JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

Abstract

M42 aminopeptidases יוצרים מתחמים פעילים מבחינה פונקציונלית המורכבים מ-12 יחידות משנה. נראה שתהליך ההרכבה שלהם מוסדר על ידי התורמים היונים המתכתיים שלהם, מה שמפעיל מעבר של דימר-דוקאמר. עם כריכת יון מתכת, מספר שינויים מבניים מתרחשים באתר הפעיל ובממשק האינטראקציה, מעצבים עמעום לקידום ההרכבה העצמית. כדי לצפות בשינויים כאלה, אוליגומרים יציבים חייבים להיות מבודדים לפני מחקר מבני. דווח כאן היא שיטה המאפשרת טיהור של dodecamers יציבים ועמומים של TmPep1050, M42 aminopeptidase של T. maritima, ואת קביעת המבנה שלהם על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. דימרים הוכנו מ-dodecamers על ידי הסרת יונים מתכת עם סוכן chelating. ללא קופקטור שלהם, dodecamers הפך פחות יציב ונתק לחלוטין עם החימום. המבנים האוליגומריים נפתרו על ידי גישת ההחלפה המולקולרית הפשוטה. כדי להמחיש את המתודולוגיה, המבנה של גרסה TmPep1050, פגום לחלוטין בכריכת יון מתכת, מוצג לא מראה פירוט נוסף של dimers מונומרים.

Introduction

אוליגומרציה היא תהליך דומיננטי המכתיב את הפונקציות הביולוגיות של חלבונים רבים. ב Escherichia קולי, ההערכה היא כי רק 35% של חלבונים הם מונומריים1. חלבונים מסוימים, הנקראים מורפיינים, יכולים אפילו לאמץ מספר מצבים אוליגומריים עם יחידות משנה בעל מבנה נפרד בכל מצב אוליגומרי2. המעבר בין מצבם האוליגומרי הוא לעתים קרובות מתכוון לווסת את פעילות החלבון כמו כל מצב אוליגומרי עשוי להיות פעילות או פונקציה ספציפית שונה. מספר דוגמאות למורפיין תועדו היטב בספרות, במיוחד את סינתאזפורפובילינוגן 3, HPr קינאז/פוספטאז4, פרוטאזלון 5, להקטאט דהידג’נאז6, גליצרלדהיד-3-פוספט דהידג’נאז7, פירווט קינאז8, סינתזיטציטראט 9, וריבנוקלאז A10. לאחרונה, תיארנו M42 aminopeptidase TmPep1050, דוגמה נוספת של אנזים עם התנהגות כמו מורפיין, שפעילותו תלויה במצבים האוליגומרייםשלה 11. המעבר בין המדינות האוליגומריות שלה מתווכת על ידי הגורמים המתכתיים שלה, מה שגורמים למספר שינויים מבניים של יחידות המשנה.

משפחת M42 aminopeptidase שייכת לשבט MH12,13, והיא מחולקת באופן נרחב בקרב חיידקים וארכאה14. M42 aminopeptidases הם אנזימים די-גרעין אמיתיים משפיל פפטידים עד 35 שאריות חומצת אמינובאורך 15. הם מאמצים מבנה מוזר בצורת טטריהדרון עשוי מ-12 יחידות משנה עם האתרים הפעילים שלהם הכיוון לחלל הפנימי. הסדר כזה מתואר לעתים קרובות בשם ננו-מידור של הפעילות כדי למנוע פרוטאוליזה בלתי מבוקרת. הפונקציה הפיזיולוגית של M42 aminopeptidases עשוי להיות קשור פרוטאזום, פפטידים הידרוליזההנובעים מירידהבחלבון 16,17. Pyrococcus horikoshii בעל ארבעה M42 aminopeptidases, כל אחד מציג ייחודי אך משליםפרטים 18,19,20,21. באופן ייחודי, תסביכות הטרוסקסואליות המורכבות משני סוגים שונים של יחידות משנה תוארו בפ. horikoshii, מה שמצביע על קיומם שלמתחמים פפטידים 22,23.

בספרות תוארו מספר מבנים של M42 aminopeptidases11,16,18,19,20,24,25,26. תחום המשנה מורכב משני תחומים נפרדים, קבוצת מחשבים קתטית ותחום דימיטים. התחום הקתליטי מאמץ פיפול α/β משותף שנצמר בכל שבט MH, התחום הקטליטי הארכיטיפי הוא ה-Ap1 של Vibrio proteolyticus27. תחום dimerization מאמצת קיפול PDZ כמו16 ואולי יש, בנוסף לתפקידה oligomerization, תפקיד בשליטה על גישה למצע ואיגוד בחלל הפנימי11. מכיוון שאבן הבניין הבסיסית היא עמומה יותר, מתואר ה-dodecamer לעתים קרובות כשיוך של שישה דימרים, שכל אחד מהם ממוקם בכל קצה של טטרהדרון16. אוליגומרציה של M42 aminopeptidases מסתמך על הזמינות של cofactors מתכת שלה. יונים מתכת Divalent, לעתים קרובות Zn2+ ו Co2+, מעורבים באופן קטליטי בכריכת פפטיד והידרוליזה. הם נמצאים בשני אתרי איגוד נפרדים, כלשהם אתרי M1 ו-M2. שני יונים מתכת גם לנהוג ולכוונן היטב את oligomerization כפי שהוכח עבור PhTET2, PhTET3, PfTET3, ו TmPep105011,24,28,29. כאשר cofactors מתכת מתרוקן, dodecamer מתפרק לתוך dimers, כמו PhTET2, PhTET3, ו TmPep105011,16,28,או אפילו מונומרים, כמו PhTET2 ו PfTET324,29.

מוצג כאן פרוטוקול המשמש לחקר המבנים של TmPep1050 אוליגומרים. פרוטוקול זה הוא קבוצה של שיטות נפוצות כולל טיהור חלבונים, הקרנת פעילות פרוטאוליטית, התגבשות, מפזר רנטגן, והחלפת מולקולרית. הדקויות הטמונות בהתמודדות עם מטאלואנזימים, אוליגומריזציה של חלבונים, התגבשות חלבונים והחלפת מולקולרית מודגשות. מקרה של מחקר מוצג גם כדי להראות אם TmPep1050 dodecamers עשויים עוד יותר לנתק לתוך מונומרים או לא. כדי לטפל בשאלה זו, גרסה TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, נחקרה שאתרי כריכת המתכת שלהם נפגעים על ידי מוטציה שלו-60 (אתר M2) ו His-307 (אתר M1) כדי Ala שאריות. פרוטוקול זה עשוי להיות מתאים ללמוד aminopeptidases M42 אחרים או כל מטאלואנזימים עם התנהגות כמו מורפיין.

Protocol

1. ייצור וטיהור של TmPep1050 רקומביננטי הערה: להלן מתוארים הליך השיבוט וטיהור של TmPep1050 מסוג פראי מותאם ממחקרקודם 11. לחלופין, ניתן לעשות את השיבוט באמצעות גן סינתטי. כדי ליצור גרסאות TmPep1050, אתר בבימויו mutagenesis ניתן לבצע בעקבות, למשל, תגובות פריימר יחיד בשיטה פרוטוקול מקבי…

Representative Results

כדי ללמוד ניתק dodecamer אפשרי לתוך מונומרים ב TmPep1050, שלו-60 ו שלו-307 codons הוחלפו על ידי אלנין קודון באמצעות גן סינתטי. גן זה שוכפל לאחר מכן בוקטור pBAD עבור ביטוי וטיהור של המשתנה המתאים TmPep1050 לאחר מכן בשם TmPep1050H60A H307A. הכרומטוגרפיה שלהחרגת גודל (איור 3B)הראתה כי לחלבון המטוהר היה ?…

Discussion

הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הבנת המעבר של דמר-dodecamer של TmPep1050 ברמה המבנית. המתודולוגיה מנוסה בעבר לקביעת המבנה של שני TmPep1050 אוליגומרים11. הצעד המאתגר ביותר היה למצוא תנאים המקדמים את הניתקות של dodecamers לעמומים יציבים. תנאים כאלה היו צריכים להיות קלים מספיק כדי לאפשר שיוך מחדש של ד?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למרטין רובר על הגהה של המאמר הזה ועל מתן הערות מועילות. הגישה לקו הקרן של Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) הייתה בתוך קבוצות הקצאת בלוקים 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochimie. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

Keywords: X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/fr/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image