Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Summary

Ce protocole a été développé pour étudier la transition dimer-dodecamer de TmPep1050, un Aminopeptidase M42, au niveau structurel. Il s’agit d’un pipeline simple qui part de la purification des protéines au traitement des données aux rayons X. Crystallogenesis, indexation d’ensemble de données, et remplacement moléculaire ont été soulignés par un cas d’étude, TmPep1050_{H60A H307A} variante.

Abstract

Les aminopeptidases M42 forment des complexes fonctionnellement actifs faits de 12 sous-units. Leur processus d’assemblage semble être régulé par leurs cofacteurs d’ions métalliques déclenchant une transition dimer-dodecamer. Lors de la liaison d’ion métallique, plusieurs modifications structurelles se produisent dans le site actif et à l’interface d’interaction, façonnant les dimers pour favoriser l’auto-assemblage. Pour observer de telles modifications, les oligomers stables doivent être isolés avant l’étude structurale. Rapporté ici est une méthode qui permet la purification de dodecamers stables et dimers de TmPep1050, un Aminopeptidase M42 de T. maritima, et leur détermination de la structure par cristallographie aux rayons X. Dimers ont été préparés à partir de dodecamers en enlevant les ions métalliques avec un agent chélateur. Sans leur cofacteur, les dodecamers sont devenus moins stables et ont été entièrement dissociés au chauffage. Les structures oligomériques ont été résolues par l’approche moléculaire simple de remplacement. Pour illustrer la méthodologie, la structure d’une variante tmpep1050, totalement altérée dans la reliure d’ion métallique, est présentée ne montrant aucune autre dégradation des dimers aux monomères.

Introduction

L’oligomérisation est un processus prédominant qui dicte les fonctions biologiques de nombreuses protéines. Dans Escherichia coli, on estime que seulement 35% des protéines sont monomères¹. Certaines protéines, appelées morphéines, peuvent même adopter plusieurs états oligomériques avec des sous-unités ayant une structure distincte dans chaque état oligomérique². La transition entre leurs états oligomériques est souvent un moyen de réguler l’activité protéique car chaque état oligomérique peut avoir une activité ou une fonction spécifique différente. Plusieurs exemples de morphétines ont été bien documentés dans....

Protocol

1. Production et purification de tmpep1050 recombinant

NOTE: Ci-après sont décrits la procédure de clonage et la purification de type sauvage TmPep1050 adapté d’une étude précédente¹¹. Alternativement, le clonage peut être fait à l’aide d’un gène synthétique. Pour générer des variantes TmPep1050, la mutagenèse dirigée par le site peut être effectuée à la suite, par exemple, des réactions d’amorce unique dans la méthode du protocole parallèle (SPRINP)³⁰. Le protocole de purification peut être utilisé pour les variantes tmpep1050. L’utilisation de son étiquette doit être évitée car elle interfère ....

Results

Pour étudier une dissociation possible du dodécaamer en monomères dans TmPep1050, les codons His-60 et His-307 ont été remplacés par de l’alanine codon à l’aide d’un gène synthétique. Ce gène a ensuite été cloné dans le vecteur pBAD pour l’expression et la purification de la variante tmpep1050 correspondante par la suite nommée TmPep1050_{H60A H307A}. La chromatographie d’exclusion de taille (figure 3B) a prouvé que la protéine purifiée a eu un poids moléculaire apparent de 56 kDa (p.......

Discussion

Le protocole décrit ci-après permet de comprendre la transition dimer-dodecamer de TmPep1050 au niveau structurel. La méthodologie a été expérimentée précédemment pour déterminer la structure des deux oligomers TmPep1050¹¹. L’étape la plus difficile a été de trouver des conditions favorisant la dissociation des dodecamers en dimers stables. De telles conditions ont dû être assez douces pour permettre la réassociation des dimers dans des dodecamers quand le cofacteur d’ion en métal a été ajouté. La.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,10-phénanthroline	Sigma-Aldrich	13, 137-7
Amicon Ultra 0,5 ml Filtres centrifuges Ultracel 30K	Merck Millipore	UFC503096
Amicon Ultra 15 Filtres centrifuges Ultracel 30K	Merck Millipore	UFC903024
Benzonase Nucléase	Merck Millipore	70664-3
CCP4	N/A		visitez http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete sans EDTA	Roche	5056489001
Coot	N/A		visitez https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I	Hampton Research	HR2-110
Crystal Screen II	Hampton Research	HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1082
EasyXtal Outil 15 puits	NeXtal	132007
Escherichia coli souche PPY	N/A		voir référence 31
Escherichia coli XL1 souche bleue	Agilent	200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW	GE Healthcare Life Sciences	28-4038-42
Kit d’étalonnage Gel Filtration LMW	GE Santé Sciences de la vie	28-4038-41
Gel Filtration Standard	Biorad	1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	K0503
Index	Hampton Research	HR2-144
Litholoops	Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide	Bachem AG
Natrix 1	Hampton Research	HR2-116
Natrix 2	Hampton Research	HR2-117
Neggia plugin	Dectris	N/A	visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I	NeXtal	130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II	NeXtal	130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III	NeXtal	130726
NeXtal Tubes, JCSG Core Suite IV	NeXtal	130727
pBAD-TOPO	ThermoFisher Scientific	K430001
Phenix	N/A		visit, https://www.phenix-online.org/
Phusion, ADN polymérase haute-fidélité	ThermoFisher Scientific	F-530L
Salt RX 1	Hampton Research	HR2-107
Salt RX 2	Hampton Research	HR2-109
Tube de dialyse SnakeSkin, 3.5K MWCO	ThermoFisher Scientific	88242
Source 15Phe	GE Healthcare Life Sciences	17014702
Source 15Q	GE Healthcare Life Sciences	17094705
Superdex 200 prep grade	GE Healthcare Life Sciences	17104301
Thermotoga maritima MSB8 souche	American Type Culture Collection	ATCC 43589
TmCD00089984	DNASU Plasmid Repository	N/A
XDS	N/A		visite http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme	N/A		visite https://github.com/legrandp/xdsme