Denne protokol er udviklet til at studere dimer-dodecamer overgang af TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på det strukturelle niveau. Det er en enkel rørledning, der starter fra proteinrensning til røntgendatabehandling. Crystallogenesis, datasæt indeksering, og molekylær udskiftning er blevet understreget gennem et studie, TmPep1050H60A H307A variant.
Den M42 aminopeptidases form funktionelt aktive komplekser lavet af 12 underenheder. Deres samling proces synes at være reguleret af deres metal ion cofaktorer udløser en dimer-dodecamer overgang. Ved metalionbinding sker der flere strukturelle ændringer på det aktive sted og ved interaktionsgrænsefladen, der former dæmninger for at fremme selvsamlingen. For at observere sådanne ændringer skal stabile oligomerer isoleres forud for strukturundersøgelsen. Rapporteret her er en metode, der tillader rensning af stabile dodecamers og dimers af TmPep1050, en M42 aminopeptidase af T. maritima, og deres struktur bestemmelse ved X-ray krystallografi. Dimers blev fremstillet af dodecamers ved at fjerne metalioner med et chelaterende middel. Uden deres cofactor blev dodecamers mindre stabile og blev fuldt adskilt ved opvarmning. De oligomeriske strukturer blev løst ved hjælp af den enkle molekylære udskiftningsmetode. For at illustrere metoden præsenteres strukturen af en TmPep1050-variant, der er fuldstændig svækket i metalionbinding, og som ikke viser nogen yderligere opdeling af dimers til monomerer.
Oligomerization er en fremherskende proces, der dikterer de biologiske funktioner af mange proteiner. I Escherichia colianslås det, at kun 35 % af proteinerne er monomeriske1. Nogle proteiner, kaldet morfeeeiner, kan endda vedtage flere oligomeriske tilstande med underenheder med særskilt struktur i hver oligomeric tilstand2. Overgangen mellem deres oligomeriske tilstande er ofte et middel til at regulere protein aktivitet som hver oligomeric tilstand kan have en anden specifik aktivitet eller funktion. Flere eksempler på morfeseiner er veldokumenteret i litteraturen, navnlig porphobilinogensyntase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, laktat dehydrogenase6, glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase7, pyruvatkinase8, citratsyntetase9og ribonuclease A10. For nylig har vi beskrevet M42 aminopeptidase TmPep1050, et andet eksempel på enzym med morfemein-lignende adfærd, hvis aktivitet afhænger af dens oligomeric stater11. Overgangen mellem dens oligomeriske tilstande er medieret af dens metalliske cofaktorer, som fremkalder flere strukturelle ændringer af underenheder.
Den M42 aminopeptidase familien tilhører MH klan12,13, og er udbredt blandt bakterier og Archaea14. M42 aminopeptidases er ægte dinuclear enzymer nedbrydende peptider op til 35 aminosyre rester i længde15. De vedtager en ejendommelig tetrahedron-formet struktur lavet af 12 underenheder med deres aktive steder orienteret mod en indre hulrum. Et sådant arrangement beskrives ofte som en nanoopdelte aktivitet for at undgå ukontrolleret proteolyse. Den fysiologiske funktion af M42 aminopeptidases kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge af proteinnedbrydning 16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidases, hver præsenterer forskellige, men komplementærespecificiteter 18,19,20,21. Ental, heterocomplexes lavet af to forskellige typer af underenheder er blevet beskrevet i P. horikoshii, hvilket tyder på eksistensen af peptidasome komplekser22,23.
Flere strukturer af M42 aminopeptidaser er blevet beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheden består af to forskellige domæner, et katalytisk domæne og et dimeriseringsdomæne. Den katalytiske domæne vedtager en fælles α/ β fold bevaret i hele MH klan, den arketypiske katalytiske domæne er aminopeptidase Ap1 af Vibrio proteolyticus27. Den dimerization domæne vedtager en PDZ-lignende fold16 og kan have, ud over sin rolle i oligomerization, en rolle i at kontrollere substrat adgang og bindende i det indre hulrum11. Da den grundlæggende byggesten er en dimer, dodecamer er ofte beskrevet som sammenslutningen af seks dimers, hver dimer er placeret på hver kant af tetrahedron16. Den oligomerization af M42 aminopeptidases bygger på tilgængeligheden af sine metal cofaktorer. Divalente metalioner, ofte Zn2+ og Co2+,er katalytisk involveret i peptidbindingen og hydrolyse. De findes i to forskellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 sites. De to metalioner også køre og finjustere oligomerization som påvist for PhTET2, PhTET3, PfTET3, og TmPep105011,24,28,29. Når metal cofaktorer er opbrugt, dodecamer demonterer i dimers, ligesom i PhTET2, PhTET3, og TmPep105011,16,28, eller endda monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.
Præsenteret her er en protokol, der anvendes til at studere strukturerne i TmPep1050 oligomers. Denne protokol er et sæt af almindelige metoder, herunder proteinrensning, proteolytisk aktivitet screening, krystallisering, X-ray diffraktion, og molekylær udskiftning. Finesser iboende beskæftiger sig med metalloenzymer, protein oligomerisering, protein krystallisering og molekylær udskiftning understreges. Et studieeksemier præsenteres også for at vise, om TmPep1050 dodecamers yderligere kan dissociate i monomerer eller ej. For at løse dette spørgsmål, en TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, er blevet undersøgt, hvis metal bindingssteder er svækket ved at mutere His-60 (M2 site) og His-307 (M1 site) til Ala rester. Denne protokol kan indkvarteres til at studere andre M42 aminopeptidases eller metalloenzymer med morfem-lignende adfærd.
Den protokol, der er beskrevet heri, gør det muligt at forstå overgangen til dimer-dodecamer af TmPep1050 på det strukturelle niveau. Metoden blev tidligere oplevet til bestemmelse af strukturen af både TmPep1050 oligomers11. Det mest udfordrende skridt var at finde betingelser, der fremmer dissociation af dodecamers i stabile dimers. Sådanne forhold måtte være milde nok til at gøre det muligt at reassociere dimers til dodecamers, når metal ion cofactor blev tilføjet. Adskillelsen af oli…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Martine Roovers for korrekturlæsning af dette papir og med konstruktive kommentarer. Adgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var inden for Blokallokeringsgrupper 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |