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Biochimie

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Ce protocole a été développé pour étudier la transition dimer-dodecamer de TmPep1050, un Aminopeptidase M42, au niveau structurel. Il s’agit d’un pipeline simple qui part de la purification des protéines au traitement des données aux rayons X. Crystallogenesis, indexation d’ensemble de données, et remplacement moléculaire ont été soulignés par un cas d’étude, TmPep1050H60A H307A variante.

Abstract

Les aminopeptidases M42 forment des complexes fonctionnellement actifs faits de 12 sous-units. Leur processus d’assemblage semble être régulé par leurs cofacteurs d’ions métalliques déclenchant une transition dimer-dodecamer. Lors de la liaison d’ion métallique, plusieurs modifications structurelles se produisent dans le site actif et à l’interface d’interaction, façonnant les dimers pour favoriser l’auto-assemblage. Pour observer de telles modifications, les oligomers stables doivent être isolés avant l’étude structurale. Rapporté ici est une méthode qui permet la purification de dodecamers stables et dimers de TmPep1050, un Aminopeptidase M42 de T. maritima, et leur détermination de la structure par cristallographie aux rayons X. Dimers ont été préparés à partir de dodecamers en enlevant les ions métalliques avec un agent chélateur. Sans leur cofacteur, les dodecamers sont devenus moins stables et ont été entièrement dissociés au chauffage. Les structures oligomériques ont été résolues par l’approche moléculaire simple de remplacement. Pour illustrer la méthodologie, la structure d’une variante tmpep1050, totalement altérée dans la reliure d’ion métallique, est présentée ne montrant aucune autre dégradation des dimers aux monomères.

Introduction

L’oligomérisation est un processus prédominant qui dicte les fonctions biologiques de nombreuses protéines. Dans Escherichia coli, on estime que seulement 35% des protéines sont monomères1. Certaines protéines, appelées morphéines, peuvent même adopter plusieurs états oligomériques avec des sous-unités ayant une structure distincte dans chaque état oligomérique2. La transition entre leurs états oligomériques est souvent un moyen de réguler l’activité protéique car chaque état oligomérique peut avoir une activité ou une fonction spécifique différente. Plusieurs exemples de morphétines ont été bien documentés dans la littérature, notamment la synthase porphobilinogen3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase7, pyruvate kinase8, synthase citrate9, et ribonuclease A10. Récemment, nous avons décrit l’aminopeptidase M42 TmPep1050, un autre exemple d’enzyme avec un comportement morphéine, dont l’activité dépend de ses états oligomériques11. La transition entre ses états oligomériques est médiée par ses cofacteurs métalliques qui induisent plusieurs modifications structurelles des sous-unités.

La famille des aminopeptidase M42 appartient au clan MH12,13, et est largement répartie entre bactéries et archée14. Les aminopeptidases M42 sont de véritables enzymes dinucléaires dégradant les peptides jusqu’à 35 résidus d’acides aminés delongueur 15. Ils adoptent une structure particulière en forme de tétraèdre faite de 12 sous-units avec leurs sites actifs orientés vers une cavité intérieure. Un tel arrangement est souvent décrit comme une nano-compartimentation de l’activité pour éviter la protéolyse incontrôlée. La fonction physiologique des aminopeptidases M42 peut être associée aux peptides hydrolysants protéasomes résultant de la dégradation desprotéines 16,17. Pyrococcus horikoshii possède quatre aminopeptidases M42, chacune présentant des spécificités distinctes mais complémentaires18,19,20,21. Singulièrement, des hétérocomplexes faits de deux types différents de sous-unités ont été décrits dans P. horikoshii,suggérant l’existence des complexes peptidasome22,23.

Plusieurs structures de M42 aminopeptidases ont été décrites dans lalittérature 11,16,18,19,20,24,25,26. Le sous-unité est composé de deux domaines distincts, d’un domaine catalytique et d’un domaine de dimérisation. Le domaine catalytique adopte un pli α/β commun conservé dans tout le clan MH, le domaine catalytique archétypal étant l’aminopeptidase Ap1 de Vibrio proteolyticus27. Le domaine de la dimérisation adopte un pli16 en forme de PDZ et peut avoir, en plus de son rôle dans l’oligomérisation, un rôle dans le contrôle de l’accès au substrat et la liaison dans la cavitéinterne 11. Comme le bloc de base est un dimère, le dodécaamer est souvent décrit comme l’association de six dimers, chaque dimer étant placé à chaque bord du tétraèdre16. L’oligomérisation des aminopeptidases M42 repose sur la disponibilité de ses cofacteurs métalliques. Les ions métalliques Divalent, souvent Zn2+ et Co2+,sont catalytiques impliqués dans la liaison peptidique et l’hydrolyse. On les trouve dans deux sites de liaison distincts, à savoir les sites M1 et M2. Les deux ions métalliques conduisent et accordent finement l’oligomérisation comme démontré pour PhTET2, PhTET3, PfTET3, et TmPep105011,24,28,29. Lorsque les cofacteurs métalliques sont épuisés, le dodecamer se démonte en dimers, comme dans PhTET2, PhTET3, et TmPep105011,16,28, ou même des monomères, comme dans PhTET2 et PfTET324,29.

Présenté ici est un protocole utilisé pour étudier les structures des oligomers TmPep1050. Ce protocole est un ensemble de méthodes communes comprenant la purification de protéine, le criblage protéolytique d’activité, la cristallisation, la diffraction de rayon X, et le remplacement moléculaire. Les subtilités inhérentes au traitement des métalloenzymes, de l’oligomérisation des protéines, de la cristallisation des protéines et du remplacement moléculaire sont soulignées. Un cas d’étude est également présenté pour montrer si tmPep1050 dodecamers peut se dissocier davantage en monomères ou non. Pour répondre à cette question, une variante tmpep1050, TmPep1050H60A H307A, a été étudiée dont les sites de liaison métallique sont altérés par la mutation de His-60 (site M2) et His-307 (site M1) en résidus d’Ala. Ce protocole peut être hébergé pour étudier d’autres aminopeptidases M42 ou tout métalloenzymes avec un comportement morpheein-like.

Protocol

1. Production et purification de tmpep1050 recombinant NOTE: Ci-après sont décrits la procédure de clonage et la purification de type sauvage TmPep1050 adapté d’une étude précédente11. Alternativement, le clonage peut être fait à l’aide d’un gène synthétique. Pour générer des variantes TmPep1050, la mutagenèse dirigée par le site peut être effectuée à la suite, par exemple, des réactions d’amorce unique dans la méthode du protocole parallèle (…

Representative Results

Pour étudier une dissociation possible du dodécaamer en monomères dans TmPep1050, les codons His-60 et His-307 ont été remplacés par de l’alanine codon à l’aide d’un gène synthétique. Ce gène a ensuite été cloné dans le vecteur pBAD pour l’expression et la purification de la variante tmpep1050 correspondante par la suite nommée TmPep1050H60A H307A. La chromatographie d’exclusion de taille (figure 3B) a prouvé que la protéine purifiée a eu un poids moléc…

Discussion

Le protocole décrit ci-après permet de comprendre la transition dimer-dodecamer de TmPep1050 au niveau structurel. La méthodologie a été expérimentée précédemment pour déterminer la structure des deux oligomers TmPep105011. L’étape la plus difficile a été de trouver des conditions favorisant la dissociation des dodecamers en dimers stables. De telles conditions ont dû être assez douces pour permettre la réassociation des dimers dans des dodecamers quand le cofacteur d’ion en m?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Martine Roovers d’avoir relu ce document et d’avoir formulé des commentaires constructifs. L’accès à la ligne de faisceau Proxima 2 (synchrotron SOLEIL) faisait partie des groupes d’allocation de blocs 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
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Citer Cet Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
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