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Biochimie

थर्मोटोगा मारिटिमा M42 अमीनोपेप्टिडेस TmPep1050 के ओलिगोमेरिक राज्य संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

इस प्रोटोकॉल को संरचनात्मक स्तर पर TmPep1050, एक M42 अमीनोपेप्टिडेस के डिमर-डोडेकामर संक्रमण का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यह प्रोटीन शुद्धिकरण से लेकर एक्स-रे डेटा प्रोसेसिंग तक की सीधी पाइपलाइन है । क्रिस्टलोलोजेनेसिस, डेटा सेट इंडेक्सेशन, और आणविक प्रतिस्थापन अध्ययन के एक मामले के माध्यम से जोर दिया गया है, TmPep1050H60A H307A संस्करण ।

Abstract

M42 अमीनोपेपिडेस 12 उपइकाओं से बने कार्यात्मक रूप से सक्रिय परिसर बनाते हैं। उनकी असेंबली प्रक्रिया को उनके धातु आयन कोफैक्टरों द्वारा विनियमित किया जाता है जो एक डिमर-डोडेकेमर संक्रमण को ट्रिगर करते हैं। धातु आयन बाध्यकारी पर, कई संरचनात्मक संशोधन सक्रिय साइट में और इंटरैक्शन इंटरफेस पर होते हैं, जो आत्म-असेंबली को बढ़ावा देने के लिए डिमर्स को आकार देते हैं। इस तरह के संशोधनों का पालन करने के लिए, संरचनात्मक अध्ययन से पहले स्थिर अल्पाधिकार को अलग किया जाना चाहिए। यहां रिपोर्ट की गई एक विधि है जो TmPep1050 के स्थिर द्वादक और डाइमर्स के शुद्धिकरण की अनुमति देती है, टी मैरिटिमाका एक M42 अमीनोपेप्टिडेस, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा उनकी संरचना निर्धारण। एक चेटिंग एजेंट के साथ धातु आयनों को हटाकर दशमलव से डिमर्स तैयार किए गए थे। उनके कोफैक्टर के बिना, द्वादश कम स्थिर हो गए और गर्म करने पर पूरी तरह से अलग हो गए। ओलिगोमेरिक संरचनाओं को सीधा आणविक प्रतिस्थापन दृष्टिकोण द्वारा हल किया गया था। कार्यप्रणाली को समझाने के लिए, धातु आयन बाध्यकारी में पूरी तरह से बिगड़ा एक TmPep1050 संस्करण की संरचना, मोनोमर के लिए dimers के आगे कोई टूटने दिखा प्रस्तुत किया है ।

Introduction

ओलिगोमेराइजेशन एक प्रमुख प्रक्रिया है जो कई प्रोटीन के जैविक कार्यों को तय करती है। एस्चेरिचिया कोलाईमें यह अनुमान लगाया गया है कि केवल 35% प्रोटीन मोनोमेरिक1हैं । कुछ प्रोटीन, जिन्हें मॉर्फीिन कहा जाता है, यहां तक कि प्रत्येक अल्पाधिकारी राज्य2में अलग संरचना वाले उपइकाओं के साथ कई ओलिगोमेरिक राज्यों को भी अपना सकते हैं। उनके अल्पाधिकारी राज्यों के बीच संक्रमण अक्सर प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करने का मतलब होता है क्योंकि प्रत्येक अल्पाधिकारी राज्य में एक अलग विशिष्ट गतिविधि या कार्य हो सकता है। अफ़रीद के कई उदाहरण साहित्य में अच्छी तरह से प्रलेखित किए गए हैं, विशेष रूप से पोर्फोबिलिनोजेन सिंथेस3,एचपीआर किनेस/फॉस्फेट4,लोन प्रोटीज5,लैक्टेट डेहाइड्रोजनेज़6,ग्लाइसेरल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डेहाइड्रोजेज7,पायरुवेट किनेस8,साइट्रेट सिंथाज9,और रिबोक्लेशिकेस ए10। हाल ही में, हमने M42 aminopeptidase TmPep1050 का वर्णन किया, जो मॉर्फीिन जैसे व्यवहार के साथ एंजाइम का एक और उदाहरण है, जिसकी गतिविधि इसके ओलिगोमेरिक राज्यों पर निर्भर करती है11। इसके अल्पाधिकारी राज्यों के बीच संक्रमण इसके धातु सहकारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो उपइकाओं के कई संरचनात्मक संशोधनों को प्रेरित करते हैं।

एम42 अमीनोपेपिडेस परिवार एमएच कबीले12,13से संबंधित है और यह बैक्टीरिया और आर्चिया14के बीच व्यापक रूप से वितरित किया जाता है । एम42 अमीनोपेपिडेस वास्तविक डिस्यूक्लियर एंजाइम हैं जो पेप्टाइड्स को15लंबाई में 35 अमीनो एसिड अवशेषों तक अपमानजनक करते हैं। वे एक अजीब टेट्राहेड्रॉन के आकार की संरचना को अपनाते हैं जो 12 उपइकाओं से बना है, जिसमें उनकी सक्रिय साइटें एक आंतरिक गुहा की ओर उन्मुख होती हैं। इस तरह की व्यवस्था को अक्सर अनियंत्रित प्रोटेओलिसिस से बचने के लिए गतिविधि के नैनो-कंपार्टमेंट के रूप में वर्णित किया जाता है। एम 42 अमीनोपेपिडेस का शारीरिक कार्य प्रोटीन क्षरण16, 17के परिणामस्वरूप प्रोटेसोम, हाइड्रोलिजिंग पेप्टाइड्स से जुड़ा हो सकता है। पायरोकोकस होरीकोशिई के पास चार एम 42 अमीनोपेपिडेस होते हैं, जिनमें से प्रत्येक अलग लेकिन पूरक विशिष्टताएं18,19,20,21पेश करते हैं। पी होरिकोशिमें दो अलग-अलग प्रकार की उपइकाइकों से बने हेट्रोकॉम्प्लेक्स का वर्णन किया गया है, जो पेप्टिडासोम कॉम्प्लेक्स22,23के अस्तित्व का सुझाव देते हैं।

साहित्य 11 , 16 , 18 ,19, 20 , 24,25,26में एम42अमीनोपेपिडेस की कई संरचनाओं का वर्णन किया गया है । सबयूनिट दो अलग-अलग डोमेन, एक उत्प्रेरक डोमेन और एक डाइमराइजेशन डोमेन से बना है। उत्प्रेरक डोमेन पूरे एमएच कबीले में संरक्षित एक आम α/β गुना को अपनाता है, ठेठ उत्प्रेरक डोमेन विब्रियो प्रोटेओलिटिकस27का एमिओपेप्टिडेस एपी1 है। डिमराइजेशन डोमेन पीडीजेड-जैसे गुना16 को अपनाता है और हो सकता है कि अल्पाधिकार में इसकी भूमिका के अलावा, सब्सट्रेट एक्सेस को नियंत्रित करने और आंतरिक गुहा11में बाध्यकारी होने में भूमिका हो। चूंकि बुनियादी बिल्डिंग ब्लॉक एक डाइमर है, इसलिए डोडेकेमर को अक्सर छह डाइमर के संघ के रूप में वर्णित किया जाता है, प्रत्येक डाइमर को टेट्राहेड्रॉन16के प्रत्येक किनारे पर तैनात किया जाता है। M42 अमीनोपेप्टिडास का अल्पाधिकार इसके धातु कोफैक्टरों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। डिवेलेंट मेटल आयन, अक्सर जेडएन2 + और सीओ2 +,पेप्टाइड बाइंडिंग और हाइड्रोलिसिस में उत्प्रेरक रूप से शामिल होते हैं। वे दो अलग-अलग बाध्यकारी साइटों, अर्थात् एम 1 और एम 2 साइटों में पाए जाते हैं। दो धातु आयनों को भी ड्राइव और बारीकी से के रूप में PhTET2, PhTET3, PfTET3, और TmPep105011,24, 28,29के लिए प्रदर्शन के रूप में अल्पाधिकार धुन । जब धातु कोफैक्टर समाप्त हो जाते हैं, तो द्वादश डिमर्स में अलग हो जाता है, जैसे PhTET2, PhTET3, और TmPep105011,16,28,या यहां तक कि मोनोमर, जैसे PhTET2 और PfTET324, 29।

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो TmPep1050 अल्पाधिकार की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन शुद्धिकरण, प्रोटियोलिटिक गतिविधि स्क्रीनिंग, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन और आणविक प्रतिस्थापन सहित सामान्य तरीकों का एक सेट है। धातु, प्रोटीन ओलिगोमेराइजेशन, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और आणविक प्रतिस्थापन से निपटने के लिए निहित बारीकियों पर जोर दिया जाता है। अध्ययन का एक मामला यह दिखाने के लिए भी प्रस्तुत किया जाता है कि क्या TmPep1050 द्वादशों को मोनोमर में और अलग कर सकते हैं या नहीं । इस प्रश्न का समाधान करने के लिए, एक TmPep1050 संस्करण, TmPep1050H60A H307A,जिसका धातु बाध्यकारी साइटों अपने-६० (M2 साइट) और उसके-३०७ (M1 साइट) अला अवशेषों को उत्परिवर्तन द्वारा बिगड़ा हुआ है अध्ययन किया गया है । इस प्रोटोकॉल को अन्य M42 अमीनोपेप्टिडेस या मॉर्फीिन जैसे व्यवहार के साथ किसी भी धातुलोएंज़ीम का अध्ययन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

Protocol

1. पुनर्संयोजन TmPep1050 का उत्पादन और शुद्धिकरण नोट: इसके बाद क्लोनिंग प्रक्रिया और जंगली प्रकार TmPep1050 की शुद्धि एक पिछले अध्ययन11से अनुकूलित वर्णित हैं । वैकल्पिक रूप से, क्लोनिंग एक सिंथे?…

Representative Results

TmPep1050 में मोनोमर में एक संभावित द्वादश वियोजन का अध्ययन करने के लिए, उनके-60 और उनके-307 कोडन को सिंथेटिक जीन का उपयोग करके एलेनिन कोडन द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। तब इस जीन को इसी TmPep1050 संस्करण की अभिव्यक…

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल संरचनात्मक स्तर पर TmPep1050 के मंद-द्वादक संक्रमण को समझने की अनुमति देता है। इस पद्धति का अनुभव पहले टीएमपेप1050 ओलिगोमर दोनों की संरचना निर्धारित करनेकेलिए किया गया था । सबस…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम इस पेपर को प्रूफरीडिंग करने और रचनात्मक टिप्पणियां देने के लिए मार्टीन रोबर्स को धन्यवाद देते हैं । प्रोक्सिमा 2 बीमलाइन (SOLEIL सिंक्रोट्रॉन) तक पहुंच ब्लॉक आवंटन समूह 20151139 के भीतर थी।

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
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Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
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