Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

Summary

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un’amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all’elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l’indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050_{H60A H307A.}

Abstract

Le amminopeptidasi M42 formano complessi funzionalmente attivi fatti di 12 subunità. Il loro processo di assemblaggio sembra essere regolato dai loro cofattori ionici metallici che innescano una transizione dimero-dodecamero. Al momento del legame ionici metallici, si verificano diverse modifiche strutturali nel sito attivo e nell’interfaccia di interazione, modellando i dimeri per promuovere l’auto-assemblaggio. Per osservare tali modifiche, gli oligomeri stabili devono essere isolati prima dello studio strutturale. Qui riportato è un metodo che consente la purificazione di dodecamer stabili e dimeri di TmPep1050, un amminopeptidasi M42 di T. maritimae la loro determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X. I dimeri venivano preparati da dodecamer rimuovendo ioni metallici con un agente chelatante. Senza il loro cofattore, i dodecamer divennero meno stabili e furono completamente dissociati al riscaldamento. Le strutture oligomeriche sono state risolte con il semplice approccio di sostituzione molecolare. Per illustrare la metodologia, viene presentata la struttura di una variante TmPep1050, totalmente compromessa nel legame ionici metallici, che non mostra ulteriori dimeri in monomeri.

Introduction

L’oligomerizzazione è un processo predominante che detta le funzioni biologiche di molte proteine. In Escherichia coli, si stima che solo il 35% delle proteine siano monomeriche¹. Alcune proteine, chiamate morfeeine, possono anche adottare diversi stati oligomerici con subunità aventi una struttura distinta in ogni stato oligomerico². La transizione tra i loro stati oligomerici è spesso una media per regolare l’attività proteica in quanto ogni stato oligomerico può avere un’attività o una funzione specifica diversa. Diversi esempi di morfeeine sono stati ben documentati in letteratura, in particolare il porfobilinogeno sintasi³, HPr chinasi/fosfatasi⁴, Lon proteasi⁵, lattato deidrogenasi⁶, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi⁷, piruvato chinasi⁸, citrato sintasi⁹e ribonucleasi A¹⁰. Recentemente, abbiamo descritto l’amminopeptidasi M42 TmPep1050, un altro esempio di enzima con comportamento simile alla morfeina, la cui attività dipende dai suoi stati oligomerici¹¹. La transizione tra i suoi stati oligomerici è mediata dai suoi cofattori metallici che inducono diverse modifiche strutturali delle subunità.

La famiglia M42 aminopeptidasi appartiene al clan MH^12,13,ed è ampiamente distribuita tra Batteri e Archaea^14. Le amminopeptidasi M42 sono veri enzimi dinucleari che degradano peptidi fino a 35 residui di amminoacidi in^{lunghezza 15}. Adottano una particolare struttura a forma di tetraedro composta da 12 subunità con i loro siti attivi orientati verso una cavità interna. Tale disposizione è spesso descritta come una nano-compartimentazione dell’attività per evitare la proteolisi incontrollata. La funzione fisiologica delle amminopeptidasi M42 può essere associata al proteasome, peptidi idrolizzando risultanti dalla degradazione proteica^16,17. Pyrococcus horikoshii possiede quattro aminopeptidasi M42, ognuna delle quali presenta specifiche distinte ma complementari^18,19,20,21. Singolarmente, eterocomplessi fatti di due diversi tipi di subunità sono stati descritti in P. horikoshii, suggerendo l’esistenza di complessi peptidasomei^22,23.

Diverse strutture di M42 aminopeptidasi sono state descritte nella^{letteratura 11,16,18,19,20,24,25,26}. La subunità è composta da due domini distinti, un dominio catalitico e un dominio di dimerizzazione. Il dominio catalitico adotta una comune piega α/β conservata in tutto il clan MH, il dominio catalitico archetipico è l’amminopeptidasi Ap1 di Vibrio proteolyticus²⁷. Il dominio di dimerizzazione adotta una piega¹⁶ simile a PDZ e può avere, oltre al suo ruolo nell’oligomerizzazione, un ruolo nel controllo dell’accesso al substrato e del legame nella cavità^{interna 11}. Poiché l’elemento costitutivo di base è un dimero, il dodecamero è spesso descritto come l’associazione di sei dimeri, ognuno dei quali è posizionato ad ogni bordo del tetraedro¹⁶. L’oligomerizzazione delle aminopeptidasi M42 si basa sulla disponibilità dei suoi cofattori metallici. Gli ioni metallici divalenti, spesso Zn²⁺ e Co^2+,sono cataliticamente coinvolti nel legame peptidico e nell’idrolisi. Si trovano in due siti di binding distinti, vale a dire siti M1 e M2. I due ioni metallici guidano e ottimizzano finemente l’oligomerizzazione come dimostrato per PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep1050^11,24,28,29. Quando i cofattori metallici sono esauriti, il dodecamero si smonta in dimeri, come in PhTET2, PhTET3 e TmPep1050^11,16,28o anche monomeri, come in PhTET2 e PfTET3^24,29.

Presentato qui è un protocollo utilizzato per studiare le strutture degli oligomeri TmPep1050. Questo protocollo è un insieme di metodi comuni tra cui la purificazione proteica, lo screening dell’attività proteolitica, la cristallizzazione, la diffrazione dei raggi X e la sostituzione molecolare. Vengono enfatizzate le sottigliezze inerenti alla gestione dei metalloenzimi, all’oligomerizzazione proteica, alla cristallizzazione proteica e alla sostituzione molecolare. Viene inoltre presentato un caso di studio per dimostrare se i dodecamer TmPep1050 possono dissociarsi ulteriormente in monomeri o meno. Per rispondere a questa domanda, è stata studiata una variante TmPep1050, TmPep1050_{H60A H307A}, i cui siti di legame metallico sono compromessi mutando i residui di His-60 (sito M2) e His-307 (sito M1) ad Ala. Questo protocollo può essere ospitato per studiare altre amminopeptidasi M42 o qualsiasi metalloenzima con comportamento simile alla morfeina.

Protocol

1. Produzione e purificazione del ricombinante TmPep1050 NOTA: Di seguito sono descritte la procedura di clonazione e la purificazione di tipo selvatico TmPep1050 adattato da uno studioprecedente 11. In alternativa, la clonazione può essere eseguita utilizzando un gene sintetico. Per generare varianti TmPep1050, la mutagenesi diretta dal sito può essere eseguita seguendo, ad esempio, le reazioni a singolo primer nel metodo SPRINP (Parallel Protocol)30<…

Representative Results

Per studiare una possibile dissociazione del dodecamero in monomeri in TmPep1050, i codoni His-60 e His-307 sono stati sostituiti da alanina codone usando un gene sintetico. Questo gene è stato quindi clonato nel vettore pBAD per l’espressione e la purificazione della corrispondente variante TmPep1050 successivamente denominata TmPep1050H60A H307A. La cromatografia ad esclusione di dimensioni(figura 3B)ha mostrato che la proteina purificata aveva un peso molecolare apparente di 5…

Discussion

Il protocollo qui descritto consente di comprendere la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050 a livello strutturale. La metodologia è stata sperimentata in precedenza per determinare la struttura di entrambi gli oligomeri TmPep1050¹¹. Il passo più impegnativo è stato quello di trovare le condizioni che promuoveno la dissociazione dei dodecamer in dimeri stabili. Tali condizioni dovevano essere abbastanza miti da consentire la riassociazione dei dimeri in dodecamer al momento dell’aggiunta d…

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma-Aldrich	13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K	Merck Millipore	UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K	Merck Millipore	UFC903024
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	70664-3
CCP4	N/A		visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free	Roche	5056489001
Coot	N/A		visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I	Hampton Research	HR2-110
Crystal Screen II	Hampton Research	HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1082
EasyXtal 15-well tool	NeXtal	132007
Escherichia coli PPY strain	N/A		see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain	Agilent	200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW	GE Healthcare Life Sciences	28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW	GE Healthcare Life Sciences	28-4038-41
Gel Filtration Standard	Biorad	1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	K0503
Index	Hampton Research	HR2-144
Litholoops	Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide	Bachem AG	40010720025
Natrix 1	Hampton Research	HR2-116
Natrix 2	Hampton Research	HR2-117
Neggia plugin	Dectris	N/A	visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I	NeXtal	130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II	NeXtal	130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III	NeXtal	130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV	NeXtal	130727
pBAD-TOPO	ThermoFisher Scientific	K430001
Phenix	N/A		visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	ThermoFisher Scientific	F-530L
Salt RX 1	Hampton Research	HR2-107
Salt RX 2	Hampton Research	HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO	ThermoFisher Scientific	88242
Source 15Phe	GE Healthcare Life Sciences	17014702
Source 15Q	GE Healthcare Life Sciences	17094705
Superdex 200 prep grade	GE Healthcare Life Sciences	17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain	American Type Culture Collection	ATCC 43589
TmCD00089984	DNASU Plasmid Repository	N/A
XDS	N/A		visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme	N/A		visit https://github.com/legrandp/xdsme