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Biochimie

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

このプロトコルは、構造レベルでTmPep1050、M42アミノペプチダーゼのダイマー-ドデカマー転移を研究するために開発されました。タンパク質精製からX線データ処理まで、簡単なパイプラインです。結晶生成、データセットインデックス化、および分子置換は、研究の場合、TmPep1050H60A H307A 変異体を通じて強調されてきた。

Abstract

M42アミノペプチダーゼは、12個のサブユニットからなる機能的に活性な複合体を形成する。彼らの組み立てプロセスは、二量体ドーデカメア転移を引き起こす金属イオン補因子によって調節されているようだ。金属イオン結合の際に、アクティブ部位および相互作用界面で、自己集合を促進するためにダイマーを形成するいくつかの構造修飾が起こる。このような修飾を観察するには、構造研究の前に安定したオリゴマーを単離する必要があります。ここで報告されているのは、TmPep1050の安定したドーデカマーおよびダイマーの精製 、T.マリティマのM42アミノペプチダーゼ、およびX線結晶学によるそれらの構造決定を可能にする方法である。ダイマーは、キレート剤で金属イオンを除去することによってドーデカマーから調製した。彼らの補因子がなければ、ドデカメルは安定性が低くなり、加熱時に完全に解解化された。オリゴマー構造は、単純な分子置換アプローチによって解明された。方法論を例示するために、金属イオン結合において完全に障害を受けたTmPep1050変異体の構造は、単量体に対するダイマーのさらなる分解を示さない提示される。

Introduction

オリゴマー化は、多くのタンパク質の生物学的機能を決定する主要なプロセスです。大腸菌では、タンパク質の35%だけが単量体1であると推定されている。モルフェインと呼ばれるいくつかのタンパク質は、各オリゴマー状態2に明確な構造を有するサブユニットを有するいくつかのオリゴマー状態を採用することさえできる。それらのオリゴマー状態間の移行は、各オリゴマー状態が異なる特異的活性または機能を有し得るタンパク質活性を調節する意味であることが多い。モルフェインのいくつかの例は、文献、特にポルフォビリノーゲン合成酵素3、HPrキナーゼ/ホスファターゼ4、ロンプロテアーゼ5、乳酸脱水素酵素6、グリセアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素7、ピルビン酸キナーゼ8、クエン酸シターゼ9、およびリブコンA10において十分に文書化されている。最近、我々は、M42アミノペプチダーゼTmPep1050、モルフェイン様な挙動を有する酵素の別の例を説明し、その活性はそのオリゴマー状態11に依存する。そのオリゴマー状態間の遷移は、サブユニットのいくつかの構造修飾を誘発する金属補因子によって媒介される。

M42アミノペプチダーゼファミリーはMH族12、13に属し、細菌と古細菌14の間で広く分布している。M42アミノペプチダーゼは、長さ15のアミノ酸残基を最大35個までペプチドを分解する本物の二核酵素である。彼らは、内側の空洞に向けられたアクティブな部位を持つ12のサブユニットで作られた独特の四面体型の構造を採用しています。このような配置は、制御されていないタンパク質分解を避けるために活性のナノ区画化としてしばしば記述される。M42アミノペプチダーゼの生理機能は、プロテアソームに関連付けてもよいし、タンパク質分解から生じるペプチドを加水分解する16、17。ピロコッカス堀越は4つのM42アミノペプチダーゼを持ち、それぞれが18、19、20、21の別個の、しかし相補的な特異性を提示する。単独では、2種類のサブユニットからなるヘテロ複合体がP.堀越しに記載されており、ペプチダソーム複合体22,23の存在を示唆している。

M42アミノペプチダーゼのいくつかの構造は、文献11、16、18、19、20、24、25、26に記載されている。サブユニットは、触媒ドメインと二量体化ドメインの2つの異なるドメインで構成されています。触媒ドメインは、MH族全体に保存された共通のα/βフォールドを採用し、ビブリオプロテオリチクス27のアミノペプチダーゼAp1である原型触媒ドメインである。二量体化ドメインはPDZ様の折り目16を採用し、オリゴマー化におけるその役割に加えて、内腔11における基板アクセスおよび結合を制御する役割を有し得る。基本的なビルディングブロックがダイマーであるため、ドーデカマーは、6つのダイマーの関連としてしばしば記述され、各ダイマーは四面体16の各縁に位置付けられている。M42アミノペプチダーゼのオリゴマー化は、その金属補因子の可用性に依存しています.二価金属イオンは、しばしばZn2+およびCo2+、ペプチド結合および加水分解に触媒的に関与している。これらは、M1 サイトと M2 サイトという 2 つの異なるバインド サイトに存在します。また、この2つの金属イオンは、PhTET2、PhTET3、PfTET3、およびTmPep105011、24、28、29に対して実証されているように、オリゴマー化を駆動し、細かく調整する。金属補因子が枯渇すると、ドーデカマーは、PhTET2、PhTET3、およびTmPep105011、16、28、あるいはPhTET2およびPfTET324、29のような単量体のようにダイマーに分解する。

ここで提示されるプロトコルは、TmPep1050オリゴマーの構造を研究するために使用されます。このプロトコルは、タンパク質精製、タンパク質分解活性スクリーニング、結晶化、X線回折、分子置換などの一般的な方法のセットです。メタロ酵素、タンパク質オリゴマー化、タンパク質の結晶化、分子置換に固有の機微が強調されています。研究のケースはまた、TmPep1050ドーデカマーがモノマーにさらに解離することができるかどうかを示すために提示されています。この質問に対処するために、TmPep1050変異体であるTmPep1050H60A H307Aは、His-60(M2部位)およびHis-307(M1部位)をアラ残基に変異させることによって金属結合部位が損なわれる研究を行った。このプロトコルは、他のM42アミノペプチダーゼまたはモルフェイン様の挙動を有する任意のメタロ酵素を研究するために収容されてもよい。

Protocol

1. 組換えTmPep1050の製造と精製 注:以下、以前の研究11から適応した野生型TmPep1050のクローニング手順と精製について説明する。あるいは、クローニングは、合成遺伝子を用いて行うことができる。TmPep1050変異体を生成するために、部位指向変異誘発は、例えば、単一プライマー反応を並列プロトコル(SPRINP)法30で以下に行うことができる。…

Representative Results

TmPep1050で単量体へのドーデカマー解離の可能性を研究するために、His-60およびHis-307コドンは合成遺伝子を使用してアラニンコドンに置き換えられました。この遺伝子は、次に、TmPep1050変異体の発現および精製のためにpBADベクターでクローン化された後、TmPep1050H6050 H307Aと名付けた。サイズ排除クロマトグラフィー(図3B)は、精製タンパク質が56kDa(モノマーの分子…

Discussion

本明細書に記載されたプロトコルは、構造レベルでのTmPep1050のダイマー・ドデカマー転移を理解することを可能にする。方法論は、両方のTmPep1050オリゴマー11の構造を決定するために以前に経験した。最も困難なステップは、安定したダイマーへのドーデカマーの解離を促進する条件を見つけることでした。このような条件は、金属イオン補因子が添加されたときにドーマ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この論文を校正し、建設的なコメントをしてくれたマーティン・ルーバーに感謝します。Proxima 2ビームライン(SOLEILシンクロトロン)へのアクセスは、ブロック割り当てグループ20151139内に含まれました。

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
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Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
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