微量和外显子的纸基预集中和分离
Summary
提供是一种制造纸基装置的协议，用于有效丰富和分离微囊和外显体。
Abstract
微囊和外体是小膜囊泡释放到细胞外环境，并在整个身体中循环。由于它们含有各种亲细胞衍生生物分子，如DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质，因此它们的浓缩和分离是它们作为临床应用的潜在生物标志物被开发的关键步骤。然而，传统的分离方法（例如，超离心）对微囊和外显体造成重大损失和损害。这些方法还需要多个重复步骤的超离心，加载和浪费试剂。本文介绍了一种详细的方法，以制造一个折纸为基础的设备（Exo-PAD），旨在有效地丰富和隔离微囊和外体在简单的方式。Exo-PAD 的独特设计由手风琴样多层和收敛样品区组成，与离子浓度极化技术集成，从而使特定层的微囊和外显体具有五倍的富集。此外，通过展开 Exo-PAD，分离出富集的微囊和外显子。
Introduction
微囊和外显体是小膜囊泡，分别测量0.2±1μm和30±200nm。它们被,几个不同的细胞类型,1、2、3、4、53,分分泌入细胞,外环境。2它们含有DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质子集形式的亲细胞信息，通过各种体液（如血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水以及唾液,,6、7、8、9）7在体内循环。68因此，从生物液体中有效分离微囊和外体的技术可以在疾病的诊断、预后和实时监测以及开发新疗法方面提供广泛的机会。
然而，传统的基于超离心的微囊和外体分离方法非常耗时，并导致样品的显著损失和污染。这是因为它涉及几个繁琐的移液和装载步骤和丢弃各种试剂与重复的超离心5，6，10，11，12。6,10,11,125此外，超离心引起的高剪切应力（±100，000 x g）可导致微囊和外显子的物理解损伤，产生不良的回收率（5~23%）6、13、14。6,13,14因此，必须开发一种高效、不显眼的微囊和外体隔离技术，以减少损伤和损失，从而实现更高的回收率。
一种以折纸为基础的装置（Exo-PAD）被开发用于简单、温和、高效分离微囊和外显体6。Exo-PAD 的设计是一种多面纸，具有连续连接的样品区域，直径逐渐减小。离子浓度极化（ICP）技术是一种纳米电动力学现象，预浓缩带电生物分子，并融入这一独特的设计。使用 Exo-PAD 可使特定层中的微囊和外体富集五倍，并且只需展开设备即可进行隔离。本文详细介绍了Exo-PAD，从整体器件的制造和操作到分析其使用，以说明该方法并展示具有代表性的结果6。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然 Exo-PAD 已成功用于显微和外显子的富集和分离，但应仔细考虑几个关键点：1） 设备制备期间的烤箱孵化时间和温度，2） 处理时间，3） 施加不同层数和样品面积直径的电压，以及 4） 适用于临床样品。
协议给出的孵化时间和温度是制造可靠器件的优化条件。由于印刷蜡的回流过多，较长的孵育时间或较高的温度可能会导致收敛设计失真。这将防止聚焦电场线路的形成?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了韩国国家研究基金会资助，授予NRF-2018R1D1A1A09084044。2019年，J.H.Lee得到了光格永大学的研究资助。金海林得到了韩国贸易、工业和能源部（MOTIE）的”工业专家能力发展计划”的支持，该方案由韩国技术促进研究所（KIAT）运营。P0002397，可穿戴智能设备工业融合人力资源开发计划）。
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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