신경 근육 분석을위한 쥐 보컬 폴드의 준비
Summary
이 프로토콜은 조직 화학 신경 근육 연구에 대 한 쥐 보컬 주름을 준비 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
이 튜토리얼의 목적은 조직화학 신경 근육 연구에 대한 쥐 보컬 접기의 준비를 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 쥐 후두 해부, 플래시 동결 및 보컬 주름의 저온 절제에 대한 절차를 간략하게 설명합니다. 이 연구는 세로 및 단면 평면 모두에서 저온 절 보컬 주름을 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 참신은 내성 후두 근육의 정확한 식별을 보장하고 조직 손실의 기회를 감소 극저온 절제 하는 동안 후두 추적. 수치는 두 평면에서 점진적 극저온절을 보여줍니다. 29마리의 쥐 헤미 후두는 갑상선 연골의 출현에서 전체 보컬 접이를 포함하는 첫 번째 섹션의 출현까지 극저고 를 추적했다. 전체 보컬 폴드는 두 평면의 모든 동물을 위해 시각화되었습니다. 갑상선 연골의 출현에서 두 평면에서 전체 보컬 폴드의 출현까지 의 거리에서 높은 가변성이 있었다. 무게는 후두 랜드 마크의 깊이와 상관 관계가 없었다, 개별 가변성 및 조직 준비와 관련된 다른 요인은 단면 동안 랜드 마크의 출현에 높은 가변성에 대한 책임이있을 수 있음을 시사. 이 연구는 방법론을 자세히 설명하고 조직 화학 신경 근육 조사를위한 쥐 보컬 접이를 준비하기위한 형태학적 데이터를 제시합니다. 높은 개별 가변성 때문에, 후두 랜드 마크는 조직과 조직 손실을 과분하는 것을 방지하기 위하여 극저온 절제 도중 밀접하게 추적되어야 합니다. 쥐 후두 내의 랜드 마크의 적절 한 조직 준비 및 인식을 포함 하 여 일관 된 방법론의 사용, 연구 전반에 걸쳐 일관 된 결과 지원 하 고 후두 신경 근육 메커니즘을 조사 하는 모델로 쥐 보컬 접을 사용 하 여 관심 있는 새로운 연구원을 원조.
Introduction
쥐 후두는 발달, 노화, 질병 및 약리학 에이전트에 구조적이고 기능적인 신경 근육 후두 적응을 조사하는 잘 확립 된 모델입니다1,2,3,4,5. 조직학적 방법의 일관성은 후두 연골 내에서 캡슐화 된 근육의 후두 크기, 모양 및 지형과 관련된 도전뿐만 아니라 근육 준비 및 분석에 관련된 여러 가지 복잡성이 있기 때문에이 작업 라인에 중요합니다1,6,7,8,9,10,11 . 쥐 내성 후두 근육의 작은 크기로 인해 체계적인 포함, 동결 및 냉동 절개는 일관되고 정확한 결과를 달성하는 데 중요합니다. 예를 들어, 관상 평면에서 쥐 보컬 접을 분리할 때, 내래 후두 근육 4개 중 4개의 신경근육 접합부(NMJs)는 조직 깊이11의 1.8mm 미만 내에 위치한다. 따라서, 동결 절제 동안 후두 근육 해부학의 정밀한 모니터링은 정확하게 관심의 섹션을 식별하고 조직의 과부를 방지하는 것이 필수적이다. 대상 근육의 과분은 NMJs11의 수와 지형을 부정확하게 식별할 수 있거나 랜드마크 방향 혼동으로 인해 대상 근육이 버려지면 시료 크기가 전반적으로 감소될 수 있다12. 후두 근육과 각각의 적응에 대한 새로운 모델이 개발됨에 따라 연구 전반에 걸쳐 결과가 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현가능한지 확인하는 표준 수술 절차가 필수적입니다.
이 문서의 목적은 최적의 세로 및 단면 분석을 위해 쥐 보컬 폴드의 세부 준비입니다. 우리의 실험실에서 정기적으로 사용되는 상세한 방법은 냉동 절제 동안 대상 근육 랜드 마크를 식별하기 위해 설명된다. 유사한 방법은 여러 실험실에서 사용되지만 초보 조사관이 구현할 때 신뢰할 수 있고 정확한 복제를 보장하기 위해 문헌보다 더 자세한 정보가 여기에 제공됩니다. 이 튜토리얼의 목표는 실험실 및 조사 전반에 걸쳐 일관성을 개선하기 위해 쥐 보컬 접이의 면역 조직화학 (IHC) 평가를위한 표준 방법론을 제공하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 근육 분석을 위한 쥐 보컬 주름을 준비하는 것은 각종 도전으로 제시할 수 있습니다. 후두 근육은 작고 연골에 둘러싸여 있어 표적 근육을 직접 추출하기가 어려워질 뿐만 아니라 후두 해부학 적 랜드 마크의 깊이에서 동물 들 사이에서 높은 가변성을 발견했습니다. 근육의 경우, 전체 보컬 접이식 섹션은 NMJ 분석 프로토콜(표 1)에 대한 종로 평면에서 63-126 단면(섹션당 35 μm)보다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 보조금 F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) 및 K23DC014517 (존슨, PI) 청각 장애및 건강의 국립 연구소의 다른 통신 장애에 대한 국립 연구소에서 지원되었다.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
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