神経筋解析のためのラット声帯の調製
Summary
このプロトコルは、検査用神経筋研究のためのラットの声の折り目を準備するために使用される方法を記述します。
Abstract
このチュートリアルの目的は、神経筋の研究のためのラットの声の折り目の準備を説明することです。このプロトコルは、ラット喉頭解剖、フラッシュ凍結、および声帯の凍結切断の手順を概説する。本研究では、縦方向および断面面の両方で声を折るクライオセクションの方法を説明する。このプロトコルの目新しさは、本質的な喉頭筋の正確な同定を保証し、組織喪失の可能性を低減する、凍結切断中の喉頭追跡である。図は、両方の平面の進行性の凍結切断を示しています。29匹のラットヘミ喉頭は、甲状腺軟骨の出現から、完全な声の折り目を含む最初のセクションの出現まで、凍結切断され、追跡された。完全なボーカルフォールドは、両方の平面のすべての動物のために視覚化されました。甲状腺軟骨の出現から両方の平面におけるフルボーカルフォールドの出現までの距離には、高いばらつきがあった。体重は喉頭のランドマークの深さと相関しておらず、個々の変動性および組織製剤に関連する他の要因が、断面化中のランドマークの出現における高い変動性を引き起たす可能性があることを示唆した。本研究は、方法論を詳述し、組織化学的神経筋の調査のためにラットの声の折り目を準備するための形態学的データを提示する。個人の変動性が高いため、喉頭のランドマークは、組織および組織の損失を切除することを防ぐために、凍結切断中に密接に追跡する必要があります。ラット喉頭内のランドマークの適切な組織準備と意識を含む一貫した方法論の使用は、研究全体で一貫した結果を支援し、喉頭神経筋メカニズムを調査するためのモデルとしてラットボーカルフォールドを使用することに興味を持つ新しい研究者を支援します。
Introduction
ラット喉頭は、発達、老化、疾患および薬理学的薬剤1,2,3,4,5に対する構造的および機能的な神経筋喉頭適応を調査するための確立されたモデルである。組織学的方法の一貫性は、筋肉の準備と分析に関与する複数の複雑さだけでなく、喉頭軟骨内にカプセル化された筋肉の喉頭の大きさ、形状、および地形に関連する課題があるので、この作業ラインに不可欠です1,6,7,8,9,10,11 .ラットの本来の喉頭筋のサイズが小さいため、系統的埋め込み、凍結、および凍結切断は、一貫した正確な結果を達成するために重要です。例えば、ラットの声帯をコロナ平面で切り離すとき、4つの内在性喉頭筋の神経筋接合(NJ)は、組織深度11の1.8mm未満以内に位置する。したがって、凍結切断中の喉頭筋解剖学の正確なモニタリングは、対象のセクションを正確に特定し、組織の過剰切除を防ぐことが不可欠です。ターゲット筋肉の過大な切断は、NMJs11の数と地形の不正確な識別をもたらすか、または目標筋肉がランドマークの向きの混乱のために廃棄された場合、サンプルサイズの全体的な減少をもたらす可能性があります12。喉頭筋の研究とそれぞれの適応の新しいモデルが開発される中で、結果が正確で信頼性が高く、研究全体で再現可能であることを保証するためには、標準的な手術手順が不可欠です。
本稿の目的は、最適な縦断および断面分析のためのラットの声の折り目の調製を詳述することです。当研究室で定期的に使用される詳細な方法は、凍結切断中に標的筋のランドマークを同定するために記述されています。同様の方法は複数の研究室で使用されていますが、初心者の研究者によって実装された場合に信頼性と正確なレプリケーションを確実にするために、文献よりも詳細な情報が提供されています。このチュートリアルの目的は、検査室と調査の一貫性を向上させるために、ラットの声帯の免疫組織化学(IHC)評価のための標準的な方法論を提供することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経筋解析のためのラットの声帯を準備すると、様々な課題を提示することができます。喉頭筋は軟骨に囲まれ小さいだけでなく、標的筋を直接抽出することが困難となり、喉頭解剖学的ランドマークの深部に動物間に高いばらつきも見られた。筋肉の断面平面プロトコルの場合、完全な声の折り目のセクションは、腹側甲状腺軟骨の最初の出現後に21-85セクション(1セクションあたり10 μm)?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害研究所のF31DC017053-01A1(LENELL、PI)およびK23DC014517(ジョンソン、PI)の助成金によって支えられた。
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
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