Voorbereiding van de rattenzangplooi voor neuromusculaire analyses
Summary
Dit protocol beschrijft methoden die worden gebruikt om de stemplooien van ratten voor te bereiden op histochemisch neuromusculair onderzoek.
Abstract
Het doel van deze tutorial is om de voorbereiding van de stemplooi van de rat voor histochemische neuromusculaire studie te beschrijven. Dit protocol schetst procedures voor larynxdissectie van ratten, flash-bevriezing en cryosectie van de stemplooien. Deze studie beschrijft hoe cryosectie stemplooien in zowel longitudinale als cross-sectionele vlakken. Een nieuwigheid van dit protocol is de larynxtracking tijdens cryosectioning die zorgt voor een nauwkeurige identificatie van de intrinsieke larynxspieren en de kans op weefselverlies vermindert. Cijfers tonen de progressieve cryosectie in beide vlakken aan. Negenentwintig rattenhemi-larynges werden gecryopteerd en gevolgd vanaf het verschijnen van het schildklierkraakbeen tot het verschijnen van het eerste gedeelte dat de volledige stemplooi omvatte. De volledige stemplooi werd gevisualiseerd voor alle dieren in beide vlakken. Er was een grote variabiliteit in de afstand van het verschijnen van het schildklierkraakbeen tot het verschijnen van de volledige stemplooi in beide vlakken. Gewicht was niet gecorreleerd aan de diepte van larynxoriëntatiepunten, wat suggereert dat individuele variabiliteit en andere factoren die verband houden met weefselvoorbereiding verantwoordelijk kunnen zijn voor de hoge variabiliteit in het uiterlijk van oriëntatiepunten tijdens secties. Deze studie beschrijft een methodologie en presenteert morfologische gegevens voor het voorbereiden van de stemplooi van de rat voor histochemisch neuromusculair onderzoek. Vanwege de hoge individuele variabiliteit moeten larynxoriëntatoren tijdens cryosectie nauwlettend worden gevolgd om oversectioning van weefsel en weefselverlies te voorkomen. Het gebruik van een consistente methodologie, inclusief adequate weefselvoorbereiding en bewustzijn van oriëntatiepunten in het strottenhoofd van de rat, zal helpen bij consistente resultaten in alle onderzoeken en nieuwe onderzoekers helpen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de stemplooi van de rat als een model om larynx neuromusculaire mechanismen te onderzoeken.
Introduction
Het strottenhoofd van de rat is een goed ingeburgerd model om structurele en functionele neuromusculaire larynxaanpassingen aan ontwikkeling, veroudering, ziekte en farmacologische agentia te onderzoeken1,2,3,4,5. Consistentie van histologische methoden is van cruciaal belang voor deze manier van werken, omdat er meerdere fijne kneepjes betrokken zijn bij spiervoorbereiding en -analyse, evenals uitdagingen in verband met larynxgrootte, vorm en topografie van de spieren ingekapseld in het larynxkarbeen1,6,7,8,9,10,11 . Vanwege de kleine omvang van de intrinsieke strottenhoofdspieren van de rat zijn systematische inbedding, bevriezing en cryosectie van cruciaal belang om consistente en nauwkeurige resultaten te bereiken. Bijvoorbeeld, bij het snijden van de stemplooi van de rat in het coronale vlak, bevinden de neuromusculaire juncties (NMJ’s) van vier van de intrinsieke larynxspieren zich binnen minder dan 1,8 mm weefseldiepte11. Daarom is nauwkeurige monitoring van de anatomie van de larynxspier tijdens cryosectioning noodzakelijk om de sectie (s) van belang nauwkeurig te identificeren en oversectie van weefsel te voorkomen. Oversectie van de doelspier kan resulteren in een onnauwkeurige identificatie van het aantal en de topografie van NMJ’s11 of kan resulteren in een algehele vermindering van de steekproefgrootte als de doelspier wordt weggegooid als gevolg van oriëntatierichtingsverwarring12. Aangezien nieuwe modellen voor de studie van larynxspieren en hun respectieve aanpassingen worden ontwikkeld, zijn standaard operationele procedures essentieel om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn in alle onderzoeken.
Het doel van dit artikel is om de voorbereiding van de stemplooi van de rat te detailleren voor optimale longitudinale en cross-sectionele analyse. Gedetailleerde methoden die regelmatig in ons laboratorium worden gebruikt, worden beschreven om doelspieroriëntatoren tijdens cryosectie te identificeren. Hoewel vergelijkbare methoden in verschillende laboratoria worden gebruikt, wordt hier meer detail verstrekt dan in de literatuur om betrouwbare en nauwkeurige replicatie te garanderen wanneer deze door beginnende onderzoekers wordt geïmplementeerd. Het doel van deze tutorial is om een standaardmethodologie te bieden voor immunohistochemische (IHC) evaluatie van de stemplooi van de rat om de consistentie tussen laboratoria en onderzoeken te verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voorbereiden van stemplooien van ratten voor neuromusculaire analyse kan verschillende uitdagingen met zich meebrengen. Niet alleen zijn larynxspieren klein en omgeven door kraakbeen, waardoor het moeilijk is om direct doelspier te extraheren, er werd ook een hoge variabiliteit gevonden tussen dieren in de diepte van larynxanatomische oriëntatiepunten. Voor spier het cross-section plane protocol, volledige stemplooisecties verschenen tussen 21−85 secties (10 μm per sectie) na het eerste verschijnen van het ventra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) en K23DC014517 (Johnson, PI) van het National Institute on Deafness and other Communication Disorders van de National Institutes of Health.
Materials
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. | |||
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
