在这里,我们描述了鼻皮质-黑猩猩有机切片的准备。在血清逐渐和可控的剥夺下,这些切片描绘了进化的癫痫样事件,可以被认为是癫痫发生的前活体模型。该系统是监测自发活动动态以及评估整个癫痫发生过程中神经炎特征进展的极好工具。
有机切片培养物已被广泛用于模拟脑部疾病,并被认为是评估药物神经保护和治疗潜力的极好平台。有机切片由外植组织制成,代表复杂的多细胞体外活体环境。它们保留了脑细胞的三维细胞结构和局部环境,维持神经元连接和神经元-胶质相互作用。河马细胞切片被认为适合探索癫痫发生的基本机制,但临床研究和癫痫动物模型表明,由腹膜和阴囊皮质组成的鼻皮质在癫痫发作生成中起着相关作用。
在这里,我们描述了鼻皮质-黑猩猩有机切片的准备。在灌注下,CA3区域在生理温度和没有药理学操作的情况下,在灌注下自发活动的记录表明,这些切片描绘了文化中整个时间演变的癫痫类事件。还观察到通过丙酸碘化物吸收检测和用荧光耦合免疫化学评估的胶质化,细胞死亡增加。提出的实验方法突出了鼻皮层-河马细胞切片培养的价值,作为研究癫痫发生动态和进展以及筛查大脑病理学潜在治疗目标的平台。
癫痫是全世界最普遍的神经系统疾病之一,其特征是大脑中同步和过度神经元活动的周期性和不可预知性发生。尽管有各种抗癫痫药物(AEDs),三分之一的癫痫患者对治疗1 有难治性,并且继续经历癫痫发作和认知衰退。此外,可用的 AED 由于对神经元活动相对普遍的操作而妨碍认知。癫痫在人类中很难研究,因为多发性和异质性癫痫性损伤,持续数月至数十年的漫长潜伏期,以及第一次自发发作后抗惊厥治疗的误导性影响。
由于癫痫动物模型,确定治疗癫痫的潜在治疗剂已成为可能:1) 遗传模型,使用遗传倾向动物,在这种动物中,癫痫发作是自发发生的或对感官刺激的反应:2) 电刺激引起的癫痫发作模型:和 3) 使用皮洛卡平 (粘液受体激动剂), kainate (卡辛受体激动剂) 或 4 氨基皮里丁 (钾通道阻滞剂) 等的癫痫诱导药理模型。这些模型对于理解癫痫背后的行为变化以及分子和细胞机制至关重要,它们导致了许多AEDs2的发现。
活体制剂也是探索癫痫发生和成语背后的机制的有力工具。急性海马片,使电子生理学研究活细胞在6-12小时期间,和有机海马片,可以保存在孵化器在几天或几个星期内已广泛用于癫痫活性3的研究。
有机脑片是从外植组织中制备的,代表大脑的生理三维模型。这些切片保留了感兴趣区域的细胞结构,包括所有脑细胞及其细胞间交流4。 长期有机文化最常用的区域是海马,因为该地区受多种神经退行性条件下神经元损失的影响。它们被广泛用于模拟脑部疾病,被认为是评估药物神经保护和治疗潜力的极好工具。在海马器官切片7、8、9、10中描述了癫痫、中风和A+诱发毒性的模型。帕金森病在腹膜脑膜和纹状体,以及皮层-语料库-细胞-纹状体-亚斯坦蒂娅尼格拉,有机切片11探索。有机脑切片培养模仿轴心授精和小脑功能的许多方面,是研究多发性硬化症12的新疗法策略的广泛模型。
然而,临床研究和癫痫动物模型表明,由腹膜和内皮质组成的鼻皮质在癫痫发作第13代中起着一定的作用。因此,在鼻皮质-河马细胞切片中建立了癫痫发生模型。在血清逐渐和可控的剥夺下,鼻皮质-河马细胞型切片描绘了进化的癫痫样事件,不像总是保存在含有血清的介质中的类似切片。
在癫痫症中,与中枢神经系统的许多急性和慢性疾病一样,神经中心视力无法阐明疾病发病和进展背后的机制。临床和实验证据表明,脑部炎症是导致癫痫过程的关键因素之一,其中微胶质和星形细胞起着相关作用。癫痫动物模型的药理实验表明,通过靶向亲炎途径可以达到抗癫痫作用,而如今神经炎症被认为是开发癫痫15治疗方法的新选择。
在这里,我们彻底描述了鼻皮质-河马细胞切片培养物的准备情况,以及记录自发性癫痫活性的细节。我们强调,该系统模仿癫痫的几种神经炎方面,因此适合探索胶质细胞和神经炎在这个病理学中的作用。此外,它代表着一个易于使用的平台,用于筛查癫痫的潜在治疗方法。
癫痫的动物模型对于许多抗癫痫药的发现至关重要,但是它们需要许多动物,而且由于癫痫发作的潜在期,它们大多很耗时。海马急性切片中癫痫活性的低镁诱导也已在文献3中进行了彻底修改,但急性切片具有6-12小时生存能力,无法评估长期变化。有机切片可以在文化中维持数天到数周,从而克服急性切片的短暂生存时间,并提出了有机海马片的癫痫发生模型3,7,8。
在这里,我们描述器官切片的准备,包括鼻皮质和海马。这些切片需要15-20分钟准备每个动物,从动物牺牲开始,直到将切片放置到插入物上,每个半球可以获得6-8片。打开半球暴露海马体时,以及切片后从滤纸中取出组织时,必须格外小心。海马上方的过量组织也会在切片过程中损害切片完整性。
鼻皮质-河马细胞型切片描绘了一种进化的癫痫样活动,类似于体内癫痫。在文化中一周后,大多数片断描绘了混合的间歇和类似ictal的活动,这些活动在文化中随着时间的流传而发展到完全像ictal一样的活动。到目前为止,我们在2-3周内记录的切片间放电很少。在这个系统中,癫痫样活动的发展速度似乎比有机海马片快。这可能归因于鼻皮层的存在,它保留了海马的大部分功能输入。为了充分解决这个问题,目前正在对这些切片在文化中在整个时间内显示的癫痫信号进行完整描述,例如ictal事件的数量和持续时间,以及它们的振幅和频率。
该系统可以在培养中维持三周以上,并模仿癫痫的许多分子相关性,如神经元死亡、微胶质和星形细胞的激活以及增加亲炎细胞因子14的产生,从而使这些方面具有长期特征。它还代表一个易于使用的筛查平台,可以实施针对特定细胞通路的药理干预措施,并测试潜在的治疗目标。毫无疑问,本文所介绍的系统有助于进一步启发癫痫发生机制。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢美第奇纳分子研究所生物成像股对图像采集的所有建议。
该项目已获得欧洲联盟Horizon 2020研究和创新方案的资金,根据赠款协定,诺952455、通过PTDC/MEDFAR/30933/2017项目获得特克诺诺尼亚基金会(FCT)和利斯博亚大学医学学院法库达德。
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
Nail polish | Cliché | ||
Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
Platinum 5 blades | Gillette | ||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |