Her beskriver vi utarbeidelsen av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Under en gradvis og kontrollert deprivasjon av serum skildrer disse skivene utviklende epileptiske hendelser og kan betraktes som en ex vivo-modell av epileptogenese. Dette systemet representerer et utmerket verktøy for å overvåke dynamikken i spontan aktivitet, samt for å vurdere utviklingen av nevroinflammatoriske egenskaper gjennom hele epileptogenesen.
Organotypiske skivekulturer har blitt mye brukt til å modellere hjernesykdommer og regnes som gode plattformer for å evaluere et legemiddels nevrobeskyttende og terapeutiske potensial. Organotypiske skiver fremstilles fra utplantet vev og representerer et komplekst multicellulært ex vivo-miljø. De bevarer den tredimensjonale cytoarkitturen og det lokale miljøet i hjerneceller, opprettholder nevronal tilkobling og nevron-glia gjensidig interaksjon. Hippocampal organotypiske skiver anses egnet til å utforske de grunnleggende mekanismene for epileptogenese, men klinisk forskning og dyremodeller av epilepsi har antydet at rhinal cortex, sammensatt av perirhinale og entorhinale kortikaler, spiller en relevant rolle i anfallsgenerering.
Her beskriver vi utarbeidelsen av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver. Registreringer av spontan aktivitet fra CA3-området under perfusjon med komplett vekstmedium, ved fysiologisk temperatur og i fravær av farmakologiske manipulasjoner, viste at disse skivene skildrer utviklende epileptiske hendelser gjennom tidene i kulturen. Økt celledød, gjennom propidiumjoddopptaksanalyse, og gliose, vurdert med fluorescens-koblet immunhiistokjemi, ble også observert. Den eksperimentelle tilnærmingen som presenteres fremhever verdien av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skivekulturer som en plattform for å studere dynamikken og progresjonen av epileptogenese og for å screene potensielle terapeutiske mål for denne hjernepatologien.
Epilepsi, en av de mest utbredte nevrologiske lidelsene over hele verden, er preget av den periodiske og uforutsigbare forekomsten av synkronisert og overdreven nevronaktivitet i hjernen. Til tross for de ulike antiepileptiske legemidlene (AEDs) som er tilgjengelige, er en tredjedel av pasientene med epilepsi ildfaste mot terapi1 og fortsetter å oppleve anfall og kognitiv nedgang. Videre hemmer tilgjengelige AEDer kognisjon på grunn av deres relativt generaliserte handlinger på nevronaktivitet. Epileptogenese er vanskelig å studere hos mennesker, på grunn av de mange og heterogene epileptogene skadene, lange latente perioder som varer måneder til tiår, og de villedende effektene av antikonvulsiv behandling etter det første spontane anfallet.
Identifisering av potensielle terapeutiske midler for behandling av epilepsi har blitt mulig på grunn av dyremodeller av epilepsi: 1) genetiske modeller, som bruker genetisk disponerte dyr der anfall oppstår spontant eller som svar på en sensorisk stimulans; 2) modeller av elektriske stimuleringsinduserte anfall; og 3) farmakologiske modeller av anfallsinduksjon som bruker pilocarpin (en muskarinreseptoragonist), kainate (en kainatreseptoragonist) eller 4-aminopyridin (en kaliumkanalblokker), blant andre. Disse modellene var avgjørende i forståelsen av atferdsendringene, samt molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for epilepsi, og de har ført til oppdagelsen av mange AEDer2.
Ex vivo preparater er også et kraftig verktøy for å utforske mekanismene som ligger til grunn for epileptogenese og ictogenesis. Akutte hippocampale skiver, som muliggjør elektrofysiologiske studier av levende celler over en 6-12 timers periode, og organotypiske hippocampal skiver som kan bevares i en inkubator over en periode på dager eller uker, har blitt mye brukt i studier av epileptiform aktivitet3.
Organotypiske hjerneskiver fremstilles fra utplantet vev og representerer en fysiologisk tredimensjonal modell av hjernen. Disse skivene bevarer cytoarkitturen i interesseområdet og inkluderer alle hjerneceller og deres intercellulære kommunikasjon4. Den mest brukte regionen for langsiktige organotypiske kulturer er hippocampus, da denne regionen påvirkes av nevronal tap i flere nevrodegenerative forhold. De har blitt mye brukt til å modellere hjernesykdommer og regnes som gode verktøy for å vurdere et legemiddels nevrobeskyttende og terapeutiske potensial5,6. Modeller av epileptogenese, hjerneslag og Aβ-indusert toksisitet ble beskrevet i hippocampale organotypiske skiver7,8,9,10. Parkinsons sykdom ble utforsket i ventral mesencephalon og striatum, samt cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypiske skiver11. Organotypiske cerebellar skiver kulturer etterligner mange aspekter av axon myelinasjon og cerebellar funksjoner og er en utbredt modell for å undersøke nye terapeutiske strategier i multippel sklerose12.
Imidlertid har klinisk forskning og dyremodeller av epilepsi antydet at rhinal cortex, sammensatt av perirhinale og entorhinale kortikaler, spiller en rolle i anfallsgenerering13. Dermed ble en modell av epileptogenese i rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver etablert14. Under en gradvis og kontrollert deprivasjon av serum skildrer rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver utviklende epileptiske hendelser, i motsetning til analoge skiver som alltid holdes i et serumholdig medium.
Ved epilepsi, som i mange akutte og kroniske sykdommer i sentralnervesystemet, klarer nevrosentrisk syn ikke å belyse mekanismene som ligger til grunn for sykdomsde begynnelse og progresjon. Kliniske og eksperimentelle bevis peker på hjernebetennelse, der mikroglia og astrocytter spiller en relevant rolle, som en av de viktigste aktørene som bidrar til den epileptiske prosessen. Farmakologiske eksperimenter i dyremodeller av epilepsi antyder at antiepileptogene effekter kan oppnås ved å målrette proinflammatoriske veier, og i dag anses nevroinflammasjon som et nytt alternativ for utvikling av terapeutiske tilnærminger for epilepsi15.
Her beskriver vi grundig utarbeidelsen av rhinal cortex-hippocampus organotypiske skivekulturer, samt detaljene for registrering av spontan epileptiform aktivitet fra dem. Vi fremhever at dette systemet etterligner flere nevroinflammatoriske aspekter ved epilepsi, og er dermed egnet til å utforske rollen som glialceller og nevroinflammasjon i denne patologien. Videre representerer det en brukervennlig plattform for screening av potensielle terapeutiske tilnærminger for epilepsi.
Dyremodeller av epilepsi har vært avgjørende for oppdagelsen av mange AEDer, men de krever mange dyr, og de fleste av dem er tidkrevende på grunn av latent periode for anfallsde begynnelse. Lav-magnesium induksjon av epileptiform aktivitet i hippocampal akutte skiver har også blitt grundig revidert i litteraturen3, men akutte skiver har en 6-12 h levedyktighet som gjør det umulig å vurdere langsiktige endringer. Organotypiske skiver kan opprettholdes i kultur fra dager til uker, slik at man kan overvinne den korte levedyktighetstiden for akutte skiver, og modeller av epileptogenese i organotypiske hippocampal skiver har blitt foreslått3,7,8.
Her beskriver vi utarbeidelsen av organotypiske skiver, bestående av rhinal cortex og hippocampus. Disse skivene tar 15-20 min å forberede per dyr, fra dyreoffer til plassering av skiver på innsatsene, og 6-8 skiver per halvkule kan oppnås. Ekstra forsiktighet må tas når du åpner halvkule for å eksponere hippocampus og når du fjerner vevet fra filterpapiret etter kutting. Overflødig vev over hippocampus kan også kompromittere skiveintegriteten under kutting.
Rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver skildrer en epileptisk-lignende aktivitet som ligner in vivo epilepsi. Etter en uke i kulturen skildrer de fleste skiver blandet interictal og ictal-lignende aktivitet, som utvikler seg til utelukkende ictal-lignende hendelser med tid i kulturen. Så langt har vi registrert få interictal utslipp i skiver med 2-3 uker. I dette systemet ser epileptisk-lignende aktivitet ut til å utvikle seg raskere enn i organotypiske hippocampal skiver. Dette kan tilskrives tilstedeværelsen av rhinal cortex, som bevarer det meste av funksjonelle innspill til hippocampus. For å løse dette problemet fullt ut, utføres en fullstendig karakterisering av epileptiske signaler som vises av disse stykkene gjennom tidene i kulturen, for eksempel antall og varighet av ictal-hendelser, sammen med amplitude og frekvens.
Dette systemet kan opprettholdes i kultur i mer enn tre uker, og etterligner mange molekylære korrelasjoner av epilepsi, som nevronal død, aktivering av mikroglia og astrocytter og økt produksjon av proinflammatoriske cytokiner14, noe som gir en langsiktig karakterisering av disse aspektene. Det representerer også en brukervennlig screeningplattform, der farmakologiske intervensjoner rettet mot spesifikke cellulære veier kan implementeres og potensielle terapeutiske mål kan testes. Utvilsomt kan systemet heri presentert bidra til å ytterligere opplyse mekanismene for epileptogenese.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne Bioimaging Unit of Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, for alle forslagene om bildeinnhenting.
Dette prosjektet har fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under tilskuddsavtale Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) gjennom Project PTDC/MEDFAR/30933/2017 og Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
Nail polish | Cliché | ||
Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
Platinum 5 blades | Gillette | ||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |