Burada, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz. Serumun kademeli ve kontrollü yoksunluğu altında, bu dilimler gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder ve epileptogenezin ex vivo modeli olarak kabul edilebilir. Bu sistem, spontan aktivitenin dinamiklerini izlemek ve epileptogenez boyunca nöroinflamatuar özelliklerin ilerlemesini değerlendirmek için mükemmel bir aracı temsil eder.
Organotipik dilim kültürleri beyin bozukluklarını modellemek için yaygın olarak kullanılmıştır ve bir ilacın nöroprotektif ve terapötik potansiyelini değerlendirmek için mükemmel platformlar olarak kabul edilir. Organotipik dilimler eksizyonlu dokudan hazırlanır ve karmaşık çok hücreli eks vivo ortamı temsil eder. Beyin hücrelerinin üç boyutlu sitotarşikture ve lokal çevresini korurlar, nöronal bağlantıyı ve nöron-glia karşılıklı etkileşimini korurlar. Hipokampal organotipik dilimler epileptogenezin temel mekanizmalarını araştırmak için uygun kabul edilir, ancak klinik araştırmalar ve epilepsi hayvan modelleri, perirhinal ve entorhinal kortiklerden oluşan renal korteksin nöbet oluşturmada ilgili bir rol oynadığını öne sürmektedir.
Burada, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz. Tam büyüme ortamı ile perfüzyon altında, fizyolojik sıcaklıkta ve farmakolojik manipülasyonların yokluğunda CA3 bölgesinden spontan aktivite kayıtları, bu dilimlerin kültürde zaman boyunca gelişen epileptik benzeri olayları tasvir ettiğini göstermiştir. Propidium iyodür alma tahlilleri yoluyla hücre ölümü ve floresan bağlantılı immünotitokimya ile değerlendirilen glioz da gözlendi. Sunulan deneysel yaklaşım, epileptogenezin dinamiklerini ve ilerlemesini incelemek ve bu beyin patolojisi için potansiyel terapötik hedefleri taramak için bir platform olarak renal korteks-hipokampus organotipik dilim kültürlerinin değerini vurgulamaktadır.
Dünya çapında en sık görülen nörolojik bozukluklardan biri olan epilepsi, beyinde senkronize ve aşırı nöronal aktivitenin periyodik ve öngörülemeyen oluşumu ile karakterizedir. Mevcut çeşitli antiepileptik ilaçlara (ADE’ler) rağmen, epilepsili hastaların üçte biri tedavi1’e refrakterdir ve nöbetler ve bilişsel düşüş yaşamaya devam eder. Ayrıca, mevcut AED’ler nöronal aktivite üzerine nispeten genelleştirilmiş eylemleri nedeniyle bilişi engeller. Epileptogenez, çoklu ve heterojen epileptojenik yaralanmalar, aylar ila on yıllar süren uzun gizli dönemler ve ilk spontan nöbet sonrası antikomvülsan tedavisinin yanıltıcı etkileri nedeniyle insanlarda çalışmak zordur.
Epilepsi tedavisi için potansiyel terapötik ajanların tanımlanması, epilepsi hayvan modelleri nedeniyle mümkün hale gelmiştir: 1) nöbetlerin kendiliğinden veya duyusal bir uyarana yanıt olarak meydana geldiği genetik yatkın hayvanları kullanan genetik modeller; 2) elektriksel stimülasyon kaynaklı nöbet modelleri; ve 3) pilokarpin (bir kas-nüksör agonist), kainat (kainat reseptör agonisti) veya 4-aminopyridin (potasyum kanal bloker) kullanan nöbet indüksiyonunun farmakolojik modelleri. Bu modeller, epilepsinin altında bulunan moleküler ve hücresel mekanizmaların yanı sıra davranış değişikliklerinin anlaşılmasında çok önemliydi ve birçokAED’ninkeşfedilmesine yol açtılar 2 .
Ex vivo preparatları ayrıca epileptogenez ve iktogenezin altında kalan mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araçtır. 6-12 saatlik bir süre boyunca canlı hücrelerin elektrofizyolojik çalışmalarını sağlayan akut hipokampal dilimler ve bir inkübatörde günler veya haftalar boyunca korunabilen organotipik hipokampal dilimler epileptikform aktivite çalışmalarında yoğun olarak kullanılmaktadır3.
Organotipik beyin dilimleri eksiz dokudan hazırlanır ve beynin fizyolojik üç boyutlu modelini temsil eder. Bu dilimler ilgi çekici bölgenin sitotarşiktürü korur ve tüm beyin hücrelerini ve hücreler arası iletişimlerini içerir4. Uzun süreli organotipik kültürler için en çok kullanılan bölge hipokampus’tür, çünkü bu bölge birden fazla nörodejeneratif durumda nöronal kayıptan etkilenir. Beyin bozukluklarını modellemek için yaygın olarak kullanılmıştır ve bir ilacın nöroprotektif ve terapötik potansiyelini değerlendirmek için mükemmel araçlar olarak kabuledilirler 5,6. Hipokampal organotipik dilimlerde epileptogenez, inme ve Aβ kaynaklı toksisite modelleritanımlanmıştır 7,8,9,10. Parkinson hastalığı ventral mezensefalon ve striatum’un yanı sıra korteks-korpus callosum-striatum-substantia nigra, organotipik dilimlerde araştırıldı11. Organotipik serebellar dilim kültürleri akson miyelinasyon ve serebellar fonksiyonların birçok yönünü taklit eder ve multipl sklerozda yeni terapötik stratejileri araştırmak için yaygın bir modeldir12.
Bununla birlikte, epilepsinin klinik araştırmaları ve hayvan modelleri, perirhinal ve entorhinal kortizonlar tarafından oluşturulan renal korteksin nöbet kuşağında rol oynadığını öne sürtür13. Böylece, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerde epileptogenez modeli kuruldu14. Serumun kademeli ve kontrollü yoksunluğu altında, rinal korteks-hipokampus organotipik dilimler, her zaman serum içeren bir ortamda tutulan benzer dilimlerin aksine, gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder.
Epilepside, merkezi sinir sisteminin birçok akut ve kronik hastalığında olduğu gibi, nörosantrik görme, hastalığın başlangıcı ve ilerlemesinin altında kalan mekanizmaları aydınlatamaz. Klinik ve deneysel kanıtlar, mikroglia ve astrositlerin epileptik sürece katkıda bulunan kilit oyunculardan biri olarak ilgili bir rol oynadığı beyin iltihabına işaret eder. Epilepsi hayvan modellerinde farmakolojik deneyler, antiepileptojenik etkilerin pro-enflamatuar yolların hedeflenmesiyle elde edilebileceğini göstermektedir ve günümüzde nöroinflamatuar epilepsi için terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için yeni bir seçenek olarak kabul edilir15.
Burada, rinal korteks-hipokampus organotipik dilim kültürlerinin hazırlanmasını ve onlardan spontan epileptiform aktivitenin kaydedilip kaydedilmemiş bunların ayrıntılarını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu sistemin epilepsinin birkaç nöroinflamatuar yönünü taklit ettiğini, bu nedenle glial hücrelerin ve nöroinflamatuarasyonun bu patolojideki rolünü keşfetmeye uygun olduğunu vurguluyoruz. Ayrıca, epilepsi için potansiyel terapötik yaklaşımların taranmasının kolay bir platformunu temsil eder.
Epilepsi hayvan modelleri birçok AED’nin keşfi için çok önemli olmuştur, ancak birçok hayvan gerektirir ve çoğu nöbet başlangıcı için gizli süre nedeniyle zaman alıcıdır. Hipokampal akut dilimlerde epilepsiform aktivitenin düşük magnezyum indüksiyonu da literatürde iyice revize edilmiştir3, ancak akut dilimler 6-12 saat canlılığa sahiptir ve bu da uzun süreli değişikliklerin değerlendirilmesini imkansız hale getirir. Organotipik dilimler kültürde günlerce haftadan haftalara korunabilir, akut dilimlerin kısa canlılık süresinin üstesinden gelinebilir ve organotipik hipokampal dilimlerde epileptogenez modelleri önerilmiştir3,7,8.
Burada, ren korteksi ve hipokampusu içeren organotipik dilimlerin hazırlanmasını açıklıyoruz. Bu dilimlerin hayvan başına hazırlanması 15-20 dakika sürer, hayvan kurbanından başlayarak kesici uçlara dilimlerin yerleştirilmesine kadar ve yarımküre başına 6-8 dilim elde edilebilir. Hipokampusu açığa çıkarmak için yarımküreyi açarken ve dokuyu dilimlemeden sonra filtre kağıdından çıkarırken ekstra dikkatli olunmalıdır. Hipokampüsün üzerindeki fazla doku da dilimleme sırasında dilim bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
Renal korteks-hipokampus organotipik dilimler, in vivo epilepsiye benzeyen gelişen epileptik benzeri bir aktiviteyi tasvir eder. Kültürde bir hafta sonra, çoğu dilim, kültürde zamanla sadece ictal benzeri olaylara ilerleyen karışık interiktal ve ictal benzeri aktiviteyi tasvir eder. Şimdiye kadar 2-3 haftalık dilimler halinde birkaç interictal akıntı kaydettik. Bu sistemde, epileptik benzeri aktivite organotipik hipokampal dilimlere göre daha hızlı gelişir. Bu, hipokampusa fonksiyonel girdilerin çoğunu koruyan ren korteksinin varlığına bağlanabilir. Bu sorunu tam olarak ele almak için, bu dilimler tarafından kültürde zaman boyunca görüntülenen epileptik sinyallerin, ictal olayların sayısı ve süresi gibi, genlikleri ve frekansları ile birlikte tam bir karakterizasyonu yapılmaktadır.
Bu sistem kültürde üç haftadan fazla sürdürülebilir ve nöronal ölüm, mikroglia ve astrositlerin aktivasyonu ve pro-enflamatuar sitokinlerin üretiminin artması gibi epilepsinin birçok moleküler korelasyonunu taklit eder14Bu yönlerin uzun süreli bir karakterizasyonuna izin verir. Ayrıca, belirli hücresel yolları hedefleyen farmakolojik müdahalelerin uygulanabileceği ve potansiyel terapötik hedeflerin test edilebildiği kullanımı kolay bir tarama platformunu temsil eder. Kuşkusuz, burada sunulan sistem epileptogenez mekanizmalarını daha da aydınlatmaya yardımcı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, görüntü alımıyla ilgili tüm öneriler için Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes Biyogörüntüleme Birimi’ni kabul etmek istiyor.
Bu proje, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından Nº 952455 hibe anlaşması, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) projesi PTDC/MEDFAR/30933/2017 ve Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa aracılığıyla fon almıştır.
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
Nail polish | Cliché | ||
Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
Platinum 5 blades | Gillette | ||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |