Her præsenterer vi en protokol for in vitro-isolering af flere gliacellepopulationer fra en mus CNS. Denne metode giver mulighed for adskillelse af regionale microglia, oligodendrocytprecursorceller og astrocytter for at studere fænotyperne af hver i en række kultursystemer.
De metoder, der præsenteres her, viser laboratorieprocedurer for dissektion af fire forskellige regioner i centralnervesystemet (CNS) fra murine nyfødte til isolering af glial subpopulationer. Formålet med proceduren er at adskille microglia, oligodendrocytprogenitorceller (OPC’er) og astrocytter fra kortikale, cerebellar, hjernestamme og rygmarvsvæv for at lette yderligere in vitro-analyse. CNS-regionens isolationsprocedurer gør det muligt at bestemme regional heterogenitet blandt glia i flere cellekultursystemer. Hurtig CNS-regionisolering udføres efterfulgt af mekanisk fjernelse af meninges for at forhindre meningealcelleforurening af glia. Denne protokol kombinerer blid vævsdissociation og plettering på en specificeret matrix designet til at bevare celleintegritet og vedhæftning. Isolering af blandet glia fra flere CNS-regioner giver en omfattende analyse af potentielt heterogen glia, samtidig med at brugen af individuelle forsøgsdyr maksimeres. Derudover er blandet glia efter dissociation af regionalt væv yderligere opdelt i flere celletyper, herunder microglia, OPC’er og astrocytter til brug i enten enkeltcelletype, cellekulturpladeindsatser eller samkultursystemer. Samlet set giver de demonstrerede teknikker en omfattende protokol med bred anvendelighed til omhyggelig dissektion af fire individuelle CNS-regioner fra murine nyfødte og inkluderer metoder til isolering af tre individuelle gliacelletyper til undersøgelse af regional heterogenitet i et hvilket som helst antal in vitro-cellekultursystemer eller assays.
Glia er nødvendige for korrekt neuronal funktion i CNS. De består af tre store underpopulationer, astrocytter, oligodendrocytter og microglia, hver med en anden, men alligevel uundværlig rolle1. Uden den rette gliacellediversitet og aktivitet ville neuronal funktion blive alvorligt påvirket, hvilket fører til CNS-svækkelse. Glia er i stand til at påvirke neurotransmission, og hver celletype gør det på en unik måde. Gliaceller i hjernen har kapacitet til at kommunikere indbyrdes såvel som med neuronale celler for at lette korrekt CNS-funktion2. Oligodendrocytter øger hastigheden af elektrisk transmission gennem dannelsen af en myelinskede, hvilket letter klyngedannelsen af ionkanaler ved knudepunkterne i Ranvier, stederne for neuronal handlingspotentialegeneration 3. Microglia er kritiske for beskæring af synapser ved at overvåge synaptisk transmission og “rewiring” neuronale forbindelser efter skade4. Derudover er microglia den mest rigelige residente immuncelle i CNS, der fungerer som den primære form for værtsforsvar mod patogener5. Astrocytter kan regulere synaptisk transmission mellem neuroner ved at ændre koncentrationen af ekstracellulær kalium6. De har også roller i at kontrollere lokal blodgennemstrømning7, frigive og optage neuromodulerende elementer8 og har en nøglerolle i vedligeholdelse af blod-hjerne-barriere9. Således er hver glialundertype kritisk for CNS-funktion, da defekter i enhver type længe har været forbundet med en lang række patologiske tilstande, herunder psykiatriske sygdomme, epilepsi og neurodegenerative tilstande10.
Den største hindring i studiet af CNS patobiologi er manglende evne til at undersøge humane celler i forbindelse med deres mikromiljømæssige niche. Humant biopsivæv er mest indsamlet post mortem, og celler kan let blive beskadiget eller tabt under ekstraktion og forarbejdning. Desuden er det en udfordring at holde humane celler i live og levedygtige in vitro i længere tid uden at udlede udødeliggjorte cellelinjer fra tumorer, på hvilket tidspunkt de ikke længere nøjagtigt afspejler deres normale fysiologiske egenskaber11,12. Derudover er der en betydelig mængde regional heterogenitet blandt individuelle gliacelletyper13,14,15, og det er næsten umuligt at få regionale CNS-prøver fra individuelle patienter. Som sådan er det nødvendigt at udvikle alternative modeller til at studere bidraget fra regional glia i specifikke CNS-lidelser.
Her beskriver vi et in vitro-system ved hjælp af mus CNS-regionsspecifik isolering af flere glial-subpopulationer, hvilket muliggør manipulation og kvantificering af microglia, oligodendrocytprecursorceller (OPC’er), som giver anledning til modne oligodendrocytter og astrocytter. Hver population kan uafhængigt isoleres og udsættes for en lang række eksperimentelle teknikker, herunder lægemiddel- eller molekylebehandling, immuncytokemi, protein / RNA-ekstraktion og analyse og andre samkultursystemer afhængigt af eksperimentel nødvendighed. Derudover giver denne isolationsteknik et højt celleantal, hvilket giver mulighed for karakterisering og undersøgelse af hver glialpopulation på en måde med høj kapacitet. Det muliggør også undersøgelse af CNS-celledifferentiering, vækst og spredning som reaktion på en lang række mikromiljømæssige stimuli på en kontrolleret måde for at undgå forvirrende faktorer, der typisk er til stede i en in vivo-indstilling. Endelig letter denne celleisoleringsteknik manipulation af gliacellepopulationer inden for forskellige CNS-regioner for at undersøge, hvordan regional glia interagerer med hinanden og reagerer på varierende stimuli, hvilket giver mulighed for præcision og reproducerbarhed.
I denne protokol beskriver vi isoleringen af de tre store gliacelleunderpopulationer fra musens CNS: microglia, OPC’er og astrocytter. Et stort tilbageslag for undersøgelsen af neurodegenerative og neuroinflammatoriske CNS-sygdomme er manglen på primære humane celler og væv, især dem, der er regionale og fra samme patient. I de fleste tilfælde er humane CNS-cellelinjer afledt af transformerede, udødeliggjorte kræftceller, som muligvis ikke er nøjagtige repræsentationer af deres normale fysiologiske adfærd20,21,22. Således er alternative metoder nødvendige for at studere CNS-cellefænotyper på en kontrolleret måde. Desuden gør mangfoldigheden af neurologiske gliacellepopulationer det nødvendigt at undersøge hver subtype både uafhængigt af hinanden såvel som i samkulturforhold for at rekapitulere både deres celleautonome og ikke-autonome funktioner. Gliaceller har en bred vifte af kritiske funktioner i CNS lige fra neuronal støtte23, læring / kognition 24,25 og CNS immunologiske reaktioner26. Som sådan er det nødvendigt at forstå de molekylære og cellulære funktioner i hver glial subpopulation i en fysiologisk og patologisk sammenhæng. For at gøre det giver vi her en pålidelig metode til udvinding og isolering af levedygtige glia-undertyper. På grund af praktiske og etiske begrænsninger i menneskets forskning er dyremodeller i øjeblikket de mest relevante surrogater for human gliacellebiologi. Især mus er ideelle modeldyr, da deres genom kan manipuleres og analyseres for yderligere at dissekere bestemte molekylære mekanismer, der ligger til grund for sundhed og sygdom. Derfor er den vellykkede fjernelse og adskillelse af murinmikroglia, OPC’er og astrocytter et vigtigt redskab til at undersøge gliaens funktioner under fysiologiske, neurodegenerative eller neuroinflammatoriske tilstande.
Denne protokol kan optimeres til at udforske CNS-celle regional heterogenitet. Det bliver mere og mere klart, at glia udviser regional heterogenitet i form og funktion. Astrocytter er regionalt forskellige og viser forskellig morfologi afhængigt af deres placering inden for CNS27. Desuden kan tætheden af astrocytter og deres mitotiske indeks definere anatomiske regioner, hvilket understøtter hypotesen om, at regional astrocyt heterogenitet kan afspejle molekylære og funktionelle forskelle baseret på deres placering inden for CNS28. Microglial regional heterogenitet er også under aktiv undersøgelse, selvom de underliggende mekanismer og funktionelle konsekvenser af microglia-mangfoldighed i CNS-udvikling eller adfærd i øjeblikket er uklare. Det er imidlertid kendt, at voksen microglia viser mangfoldighed i celleantal, celle- og subcellulære strukturer og molekylære signaturer29. Desuden har de seneste fremskridt inden for multiplekset massecytometri yderligere defineret mikroglias regionale heterogenitet ved at analysere cellulær fænotype fra fem forskellige CNS-regioner med ni humane donorer, hvilket giver mulighed for storskala immunophenotyping af human microglia30. I øjeblikket er sådanne tilgange i deres spirende stadier, hvilket gør dyreforsøg til en levedygtig løsning til undersøgelse af regional glia i CNS sygdomsudvikling. Endelig er regional heterogenitet også for nylig blevet beskrevet i oligodendrocytter. Enkeltcellet RNA-sekventering på 5072 individuelle celler fra 10 regioner af juvenil og voksen CNS identificerede 13 forskellige subpopulationer på tværs af forskellige stadier af differentiering31. Det er vigtigt, at det også blev konstateret, at efterhånden som oligodendrocytter modnedes fra OPC’er, divergerede deres transkriptionelle profiler, og deres funktionelle fænotyper ændrede sig, hvilket fremhævede oligodendrocyt heterogenitet inden for CNS31.
Således kan forståelse af regional heterogenitet af de forskellige residente CNS-celler i forbindelse med deres forskellige naboneuroner og andre glia give vigtig begrundelse for den fremtidige udvikling af nye terapier til behandling af neuroinflammatoriske og neurodegenerative lidelser. Mens denne protokol fokuserer på ekstraktion, isolering og identifikation af glialunderpopulationer, giver den et bekvemt udgangspunkt for undersøgelsen af deres funktion. Desuden kan det tilpasses og kombineres med transgene musemodeller for at studere genetiske mekanismer forbundet med gliacellebiologi. Det kan også bruges til at undersøge gliaceller til hinanden i samkulturassays. De skitserede trin repræsenterer en omkostningseffektiv og høj kapacitet metode til udvinding og isolering af forskellige CNS glialpopulationer, som derefter kan tilpasses en lang række eksperimentelle parametre. Det skal bemærkes; imidlertid, at metoden beskrevet her anvender nyfødte på grund af de lavere niveauer af myelinering og høj densitet af prolifererende glia. Af disse grunde er det teknisk mere muligt at isolere levedygtig glia fra nyfødte sammenlignet med voksne dyr. De fænotypiske forskelle i neonatal glia sammenlignet med voksen glia bør derfor overvejes under eksperimentelt design og datafortolkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Morgan Psenicka for manuskriptredigering og diskussion og Dr. Grahame Kidd for hjælp til figurformatering. Dette arbejde blev støttet af NIAID K22 AI125466 (JLW).
0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |