子宮内電散法における両側性を用いたパイプラインによるげっ歯類の行動に対する遺伝的影響の調査
Summary
神経精神疾患の病因における最近発見された疾患関連遺伝子の役割は依然として不明瞭である。子宮エレクトロポレーション技術における修飾された両側性は、ニューロンの大規模集団における遺伝子導入と、社会的行動に対する遺伝子発現変化の原因の影響の検討を可能にする。
Abstract
ゲノムワイド関連研究は、多くの神経疾患の異種遺伝的基盤に光を当てるにつれて、脳の発達と機能に対する特定の遺伝子の寄与を研究する必要性が高まる。トランスジェニックマウスラインは非常に高価であり、多くの新しい疾患関連遺伝子はまだ市販の遺伝的線を持っていないため、特定の遺伝子操作の役割を研究するためにマウスモデルに頼ることは必ずしも実現可能ではありません。また、マウス ラインを作成するには、開発と検証に何年もかかる場合があります。子宮内エレクトロポレーションでは、特定の遺伝子操作を達成するためにDNAプラスミドを開発するだけで必要な生体内での細胞型特異的な方法で遺伝子発現を操作する比較的迅速かつ容易な方法を提供する。子宮内の両側性のエレクトロポレーションは、前頭皮錐体錐神経細胞の大規模な集団を標的にするために使用することができる。この遺伝子導入法と行動アプローチを組み合わせることで、前頭前野ネットワークの機能や若年マウスおよび成体マウスの社会的行動に対する遺伝子操作の効果を研究することができます。
Introduction
ゲノムワイド関連研究(GWAS)は、脳病理1、2、3、4に関連する新しい候補遺伝子の発見を推進してきた。これらの研究は、統合失調症(SCZ)などの壊滅的な神経精神疾患を理解する上で特に有益であり、新しい遺伝子の調査は、新しい研究ラインと治療介入の開始点として役立っています5,6.SCZに対するリスクを抱える遺伝子は、出生前および出生後早期の発達の間に前頭前野(PFC)において偏った発現を示し、いくつかの神経精神疾患の病理に関与する領域7。さらに、精神障害のマウスモデルはPFCネットワーク6、8、9において異常な活動を示す。これらの結果は、SZC関連遺伝子がこの領域の発達配線に役割を果たす可能性があることを示唆している。動物モデルを用いたさらなる調査は、PFCにおける接続の確立に対するこれらの候補遺伝子の寄与を理解し、これらの遺伝子が神経精神疾患の病因に原因となる役割を有するかどうかを判断するために必要である。出生前および出生後の発達の間に特定の神経回路の遺伝子発現変化を研究することを可能にするマウスの遺伝子操作技術は、遺伝子発現変化をPFC機能不全に結びつける分子メカニズムを理解するための有望な方法である。
遺伝的マウスラインは、脳の発達と機能に対する特定の遺伝子の影響を研究する方法を提供します。しかし、トランスジェニックマウスに頼ることは、特定の遺伝子が神経回路の発達に及ぼす影響を調べるために必ずしも市販のラインが存在するとは限らないので、制限することができます。さらに、カスタムマウスラインを開発するには非常にコストがかかり、時間がかかる場合があります。トランスジェニックマウスとウイルスアプローチを組み合わせた交差遺伝子操作戦略の使用は、脳10、11、12の理解に革命を起こしている。多くの進歩にもかかわらず、ウイルス戦略は、ウイルス発現13およびウイルス発現14に関連する細胞毒性を制限することができる包装能力の限界を含むウイルスベクタータイプに依存する一定の制限を伴う。さらに、ほとんどの実験条件では、アデノ関連ウイルス(AAV)を用いた堅牢な遺伝子発現には約2~4週間の15週間が必要であり、出生後の早期開発中に遺伝子を操作することは不可能な日常的なウイルス戦略を作る。
子宮エレクトロポレーション(IUE)では、蛍光標識および薬理遺伝学的または光遺伝学的アプローチと相まって、神経回路の機能を解剖するための強力なプラットフォームを提供する、迅速かつ安価な遺伝子導入16、17を可能にする代替アプローチである。さらに、CRISPR-Cas9ゲノム編集遺伝子の開発により、細胞型特異的なノックダウンまたは特定遺伝子のノックアウトまたはプロモーター18、19の調節を介して過剰発現または正確に改変することができる。IUEを用いた遺伝子操作アプローチは、狭い発達窓20の間に遺伝子が神経回路に及ぼす影響をテストする必要がある場合に特に有利である。IUEは多目的な技術であり、特定のプロモーターの下で発現ベクターに遺伝子を挿入することによって容易に過剰発現を達成することができる。遺伝子発現のさらなる制御は、異なる強みのプロモーターを用いて発現を駆動するか、または遺伝子発現21,22を時間的に制御できる誘導性プロモーターを用いて達成できる。さらに、IUEは、特定の皮質層、細胞タイプおよび脳領域内の細胞の標的化を可能にするが、これは他のアプローチ5,17を使用して必ずしも実現可能ではない。より効率的な電界分布を発生させる3つの電極の使用に基づくIUE構成の最近の進歩は、この方法の機能的レパートリーを拡大し、科学者が新しい細胞タイプを標的にし、23、24を標的とすることができる細胞の効率、精度、および数を増加させることができた。この技術は、補体成分4A(C4A)、SCZに連結された遺伝子、PFC機能および早期認知5における原因の役割を決定するために最近使用された。
ここでは、PFCを含む前頭皮質の興奮性ニューロンの大規模な集団を標的とする遺伝子導入アプローチと、細胞および回路レベルの変化の研究を可能にするだけでなく、早期産後の発達および成人期を通じて行動を監視することを可能にする行動パラダイムを組み合わせた実験的パイプラインです。第1に説明する、前頭皮質領域における層(L)2/3錐体ニューロンの大きな集団を両側にトランスフェクトする方法である。次に、若年マウスおよび成体マウスにおける社会的行動をアッセイする課題について概説する。細胞数は、細胞トランスフェクションの範囲と位置を定量化する行動タスクの完了時に得ることができます。さらに、トランスフェクトされた細胞の数は、より多くのトランスフェクトされた細胞が行動のより大きな摂動につながるかどうかを判断するために行動データと相関させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書において、前頭皮質ニューロンの大きな集団における関心のある新規遺伝子の操作をマウスにおける行動アッセイと組み合わせたパイプラインが記載されている。さらに、このパイプラインは、出生後の早期発達と成人期の両方で同じマウスの行動の縦断的研究を可能にする。この技術は、時間と費用の面でコストがかかる可能性のある遺伝的動物モデルに依存する必要性をバイパ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
リサ・クレツジの批判的なフィードバックと原稿の編集に感謝します。私たちは、行動脳の灌流と細胞カウントを支援する上で非常に貴重だったクルス・マルティン研究所のすべての研究アシスタントに感謝します。三極電極の設計に関するアンジェイ・チェッチ、コンフォーカル顕微鏡の使用に対するトッド・ブルーテとボストン大学生物学イメージングコアに感謝します。この研究は、NARSADヤング・サーポジスト・グラント(AC-M、#27202)、ブレントン・R・ルッツ賞(ALC)、I.アルデン・マッキ賞(ALC)、NSF NRT UtB:神経フォトニクス国立研究フェローシップ(ALC、#DGE1633516)、ボストン大学学部研究機会プログラム(WWY)によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
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