Eine Pipeline mit bilateraler Utero-Elektroporation zur Vernehmung genetischer Einflüsse auf das Nagetierverhalten
Summary
Die Rolle der kürzlich entdeckten krankheitsassoziierten Gene bei der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen bleibt unklar. Eine modifizierte bilaterale in utero Elektroporation Technik ermöglicht den Gentransfer in großen Populationen von Neuronen und Untersuchung der ursächlichen Auswirkungen von Genexpressionsänderungen auf das Sozialverhalten.
Abstract
Da genomweite Assoziationsstudien die heterogenen genetischen Grundlagen vieler neurologischer Erkrankungen beleuchten, steigt die Notwendigkeit, den Beitrag bestimmter Gene zur Entwicklung und Funktion des Gehirns zu untersuchen. Sich auf Mausmodelle zu verlassen, um die Rolle spezifischer genetischer Manipulationen zu untersuchen, ist nicht immer möglich, da transgene Mauslinien recht teuer sind und viele neuartige krankheitsassoziierte Gene noch keine kommerziell verfügbaren genetischen Linien haben. Darüber hinaus kann es Jahre der Entwicklung und Validierung dauern, um eine Mauslinie zu erstellen. In der Gebärmutter bietet die Elektroporation eine relativ schnelle und einfache Methode, die Genexpression in einer zelltypspezifischen Weise in vivo zu manipulieren, die nur die Entwicklung eines DNA-Plasmids erfordert, um eine bestimmte genetische Manipulation zu erreichen. Bilateral ein utero Elektroporation kann verwendet werden, um große Populationen von frontalen Kortex pyramidalen Neuronen zu zielen. Die Kombination dieser Gentransfermethode mit Verhaltensansätzen ermöglicht es, die Auswirkungen genetischer Manipulationen auf die Funktion präfrontaler Kortexnetzwerke und das soziale Verhalten von jugendlichen und erwachsenen Mäusen zu untersuchen.
Introduction
Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben die Entdeckung neuartiger Kandidatengene vorangetrieben, die mit Hirnpathologienverbundensind 1,2,3,4. Diese Studien waren besonders nützlich beim Verständnis verheerender neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie (SCZ), wo die Untersuchung neuartiger Gene als Ausgangspunkt für neue Forschungslinien und therapeutischeInterventionendiente 5,6. Gene, die ein Risiko für SCZ bergen, zeigen eine voreingenommene Expression im präfrontalen Kortex (PFC) während der pränatalen und frühen postnatalen Entwicklung, einer Region, die in die Pathologie mehrerer neuropsychiatrischer Erkrankungen verwickelt ist7. Zusätzlich weisen Mausmodelle psychiatrischer Störungen eine abnormale Aktivität in PFC-Netzwerken6,8,9auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SZC-assoziierte Gene eine Rolle bei der Entwicklungsverdrahtung dieser Region spielen könnten. Weitere Untersuchungen mit Tiermodellen sind erforderlich, um den Beitrag dieser Kandidatengene zur Etablierung von Verbindungen im PFC zu verstehen und festzustellen, ob diese Gene eine ursächliche Rolle bei der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen spielen. Genetische Manipulationstechniken bei Mäusen, die die Untersuchung von Genexpressionsänderungen an bestimmten neuronalen Schaltkreisen während der pränatalen und frühen postnatalen Entwicklung ermöglichen, sind eine vielversprechende Methode, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Genexpressionsänderungen mit PFC-Dysfunktion verknüpfen.
Genetische Mauslinien bieten eine Methode, um die Auswirkungen bestimmter Gene auf die Entwicklung und Funktion des Gehirns zu untersuchen. Die Abhängigkeit von transgenen Mäusen kann jedoch einschränkend sein, da es nicht immer kommerziell verfügbare Linien gibt, um die Auswirkungen bestimmter Gene auf die Entwicklung neuronaler Schaltkreise zu untersuchen. Darüber hinaus kann es extrem teuer und zeitaufwändig sein, benutzerdefinierte Mauslinien zu entwickeln. Die Verwendung von intersektionalen genetischen Manipulationsstrategien, die transgene Mäuse mit viralen Ansätzen kombinieren, hat das Verständnis des Gehirns revolutioniert10,11,12. Trotz vieler Fortschritte haben virale Strategien je nach viralem Vektortyp gewisse Einschränkungen, einschließlich Beschränkungen der Verpackungskapazität, die die virale Expression13 einschränken können, und die Zelltoxizität im Zusammenhang mit der viralen Expression14. Darüber hinaus erfordert eine robuste Genexpression mit Adeno-assoziierten Viren (AAVs) unter den meisten experimentellen Bedingungen etwa 2 bis 4 Wochen15, was routinemäßige virale Strategien unmöglich macht, um Gene während der frühen postnatalen Entwicklung zu manipulieren.
In der Utero-Elektroporation (IUE) ist ein alternativer Ansatz, der einen schnellen und kostengünstigen Gentransfer16,17 ermöglicht, der in Verbindung mit fluoreszierender Etikettierung und pharmakogenetischen oder optogenetischen Ansätzen eine leistungsstarke Plattform bietet, um die Funktion neuronaler Schaltkreise zu sezieren. Darüber hinaus können mit der Entwicklung von CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Genen überexprimiert oder präzise verändert werden, indem zelltypspezifische Knock-down oder Knock-out von bestimmten Genen oder durch die Modulation der Promotoren18,19. Genmanipulationsansätze mit IUE sind besonders vorteilhaft, wenn die Wirkung von Genen auf neuronale Schaltkreise während schmaler Entwicklungsfenster getestet werden muss20. IUE ist eine vielseitige Technik und Überexpression kann leicht erreicht werden, indem ein Gen in einen Expressionsvektor unter einem bestimmten Promotor eingefügt wird. Eine zusätzliche Kontrolle der Genexpression kann erreicht werden, indem die Expression mit Promotoren unterschiedlicher Stärken angetrieben wird oder induzierbare Promotoren verwendet werden, die in der Lage sind, die Genexpression zeitlich zu kontrollieren21,22. Darüber hinaus ermöglicht IUE die Ausrichtung von Zellen innerhalb bestimmter kortikaler Schichten, Zelltypen und Hirnregionen, was nicht immer mit anderen Ansätzen möglich ist5,17. Jüngste Fortschritte in der IUE-Konfiguration auf der Grundlage der Verwendung von drei Elektroden, die eine effizientere Verteilung des elektrischen Feldes erzeugen, haben das funktionelle Repertoire dieser Methode erweitert und es Wissenschaftlern ermöglicht, neue Zelltypen anzusprechen und die Effizienz, Genauigkeit und Anzahl der Zellen zu erhöhen, die zielgerichtet sein können23,24. Diese Technik wurde vor kurzem verwendet, um die ursächliche Rolle der Komplementkomponente 4A (C4A), ein Gen, das mit SCZ verbunden ist, in der PFC-Funktion und frühen Kognition zu bestimmen5.
Präsentiert wird hier eine experimentelle Pipeline, die Gentransferansätze kombiniert, um große Populationen von exzitatorischen Neuronen im frontalen Kortex, einschließlich der PFC, mit Verhaltensparadigmen zu erreichen, die nicht nur die Untersuchung von Zell- und Schaltkreis-Änderungen ermöglichen, sondern auch die Überwachung des Verhaltens während der frühen postnatalen Entwicklung und des Erwachsenenalters ermöglicht. Zuerst beschrieben ist eine Methode, um große Populationen von Schicht (L) 2/3 pyramidalen Neuronen in frontalen kortikalen Regionen bilateral zu transfekieren. Als nächstes werden Aufgaben zur Assay-Sozialverhalten bei jugendlichen und erwachsenen Mäusen skizziert. Zellzählungen können nach Abschluss von Verhaltensaufgaben ermittelt werden, um das Ausmaß und die Position der Zelltransfektion zu quantifizieren. Darüber hinaus kann die Anzahl der transfizierten Zellen mit Verhaltensdaten korreliert werden, um festzustellen, ob eine größere Anzahl transfizierter Zellen zu größeren Verhaltensstörungen führt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wird eine Pipeline beschrieben, die die Manipulation neuartiger Gene von Interesse in großen Populationen von frontalkortikalen Neuronen mit Verhaltenstests bei Mäusen kombiniert. Darüber hinaus ermöglicht diese Pipeline die Längsuntersuchung des Verhaltens bei denselben Mäusen sowohl während der frühen postnatalen Entwicklung als auch im Erwachsenenalter. Diese Technik umgeht die Notwendigkeit, sich auf genetische Tiermodelle zu verlassen, die in Bezug auf Zeit und Kosten teuer sein können. Die Stärke d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Lisa Kretsge für das kritische Feedback und die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken allen wissenschaftlichen Assistenten im Cruz-Martin-Labor, die bei der Perfusion und Zellzählung von Verhaltensgehirnen von unschätzbarem Wert waren. Wir danken Andrzej Cwetsch für den Einsatz des tripolaren Elektrodens und Todd Blute und dem Boston University Biology Imaging Core für den Einsatz des konfokalen Mikroskops. Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), den Brenton R. Lutz Award (ALC), den I. Alden Macchi Award (ALC), das NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) und das Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
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