Caractérisation des cellules immunitaires et des médiateurs pro-inflammatoires en milieu pulmonaire
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de la cytométrie en flux pour identifier les changements dans la composition des cellules immunitaires, le profil des cytokines et le profil de chimiokine dans l’environnement pulmonaire après une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne, un modèle murin d’AVC ischémique.
Abstract
L’expansion, l’activation et le trafic des cellules immunitaires vers les poumons, qui sont contrôlés par l’expression de cytokines et de chimiokines multiples, peuvent être altérés par une lésion cérébrale grave. Ceci est démontré par le fait que la pneumonie est une cause majeure de mortalité chez les patients qui ont souffert d’un AVC ischémique. L’objectif de ce protocole est de décrire l’utilisation de l’analyse cytométrique en flux multicolore pour identifier 13 types de cellules immunitaires dans les poumons de souris, y compris les macrophages alvéolaires, les macrophages interstitiels, les cellules dendritiques (DC) CD103+ ou CD11b+, les DC plasmacytoïdes, les éosinophiles, les monocytes / cellules dérivées de monocytes , les neutrophiles, les cellules T et B dérivées de lymphoïdes, les cellules NK et les cellules NKT, après induction d’un AVC ischémique par occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne. De plus, nous décrivons la préparation d’homogénats pulmonaires à l’aide d’une méthode d’homogénéisation des billes, afin de déterminer les niveaux d’expression de 13 cytokines ou chimiokines différentes simultanément par des réseaux de billes multiplex couplées à une analyse cytométrique en flux. Ce protocole peut également être utilisé pour étudier la réponse immunitaire pulmonaire dans d’autres contextes pathologiques, tels que les maladies pulmonaires infectieuses ou les maladies allergiques.
Introduction
Les poumons sont un organe barrière, exposés à l’environnement extérieur et, par conséquent, subissent constamment des défis immunologiques tels que des agents pathogènes et des allergènes1. L’activation des cellules immunitaires résidentes des poumons et l’infiltration des cellules immunitaires de la périphérie sont nécessaires pour éliminer les agents pathogènes de l’environnement pulmonaire. De plus, les cellules immunitaires résidentes des poumons maintiennent une tolérance aux bactéries commensales, ce qui suggère que ces cellules jouent un rôle dans l’élimination des agents pathogènes et le maintien de l’homéostasie1. Les macrophages alvéolaires et interstitiels font partie des cellules immunitaires sentinelles résidentes des poumons qui détectent les agents pathogènes via les récepteurs de reconnaissance des formes et éliminent ces agents pathogènes par phagocytose2. Les cellules dendritiques résidentes des poumons comblent la réponse immunitaire innée et adaptative par la présentation de l’antigène3. De plus, les cellules immunitaires innées locales activées produisent des cytokines et des chimiokines qui amplifient la réponse inflammatoire et stimulent l’infiltration de cellules immunitaires telles que les monocytes, les neutrophiles et les lymphocytes dans les poumons1. Il a été démontré que l’AVC ischémique modifie l’immunité systémique et entraîne une susceptibilité accrue à l’infection pulmonaire; Cependant, peu d’études ont évalué le compartiment pulmonaire à la suite d’un AVC ischémique, bien que certaines études l’aient examiné lors de conditions inflammatoires 4,5,6,7,8,9. L’objectif des méthodes décrites ici est de déterminer simultanément la pathologie pulmonaire, la composition des cellules immunitaires et les niveaux d’expression des cytokines et des chimiokines dans les poumons afin d’évaluer les altérations du compartiment pulmonaire et d’évaluer les altérations potentielles de la réponse immunitaire pulmonaire à la suite d’un accident ischémique.
Décrit ici est un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires des poumons des souris pour identifier 13 types de cellules immunitaires. Ce protocole est basé sur la digestion tissulaire avec la collagénase D sans avoir besoin d’un dissociateur tissulaire automatisé. De plus, nous avons développé un protocole pour préparer des homogénats tissulaires qui peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux d’expression de 13 cytokines ou chimiokines différentes à l’aide de réseaux de billes multiplex basés sur la cytométrie en flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les effets de l’AVC ischémique sur l’immunité pulmonaire et peut également être utilisé dans d’autres modèles de maladies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits ici permettent l’identification des types de cellules immunitaires pulmonaires et l’expression de chimiokines ou de cytokines chez la même souris. Si une étude histopathologique est souhaitée, un lobe individuel peut être enlevé et fixé à cette fin avant de procéder aux étapes d’isolement de la cellule unique. L’une des limites de cette méthode est que cette approche peut ne pas convenir à certains contextes de maladie si l’on s’attend à ce que le changement dans la composi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention P20 GM109098 des NIH et le programme Innovation Award de Praespero à Edwin Wan. Des expériences de cytométrie en flux ont été réalisées dans le WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, qui est soutenu par les subventions NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 et P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
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