Karakterisering av immunceller og proinflammatoriske mediatorer i lungemiljøet
Summary
Denne protokollen beskriver bruken av flowcytometri for å identifisere endringene i immuncellesammensetning, cytokinprofil og kjemokinprofil i lungemiljøet etter forbigående okklusjon av cerebri cerebralis, en murine modell av iskemisk hjerneslag.
Abstract
Immuncelleutvidelse, aktivering og handel til lungene, som styres av ekspresjon av flere cytokiner og kjemokiner, kan endres ved alvorlig hjerneskade. Dette fremgår av det faktum at lungebetennelse er en viktig årsak til dødelighet hos pasienter som har lidd av iskemisk slag. Målet med denne protokollen er å beskrive bruken av flerfarget flowcytometrisk analyse for å identifisere 13 typer immunceller i lungene til mus, inkludert alveolære makrofager, interstitielle makrofager, CD103+ eller CD11b+ dendrittiske celler (DCs), plasmacytoide DCer, eosinofiler, monocytter/monocytt-avledede celler, nøytrofiler, lymfoid-avledede T- og B-celler, NK-celler og NKT-celler, etter iskemisk slaginduksjon ved forbigående okklusjon av cerebrali cerebrial arterie. Videre beskriver vi fremstilling av lungehomogenater ved hjelp av en perlehomogeniseringsmetode, for å bestemme ekspresjonsnivåene av 13 forskjellige cytokiner eller kjemokiner samtidig ved multipleksperlearrayer kombinert med flowcytometrisk analyse. Denne protokollen kan også brukes til å undersøke pulmonal immunrespons i andre sykdomsinnstillinger, for eksempel smittsom lungesykdom eller allergisk sykdom.
Introduction
Lungene er et barriereorgan, utsatt for det ytre miljø og mottar derfor stadig immunologiske utfordringer som patogener og allergener1. Aktivering av lungeboende immunceller og infiltrasjon av immunceller fra periferien er nødvendig for å fjerne patogener fra lungemiljøet. I tillegg opprettholder lungeboende immunceller toleranse for kommensale bakterier, noe som tyder på at disse cellene spiller en rolle i patogenclearance og opprettholder homeostase1. Alveolære og interstitielle makrofager er blant de lungebosatte sentinelimmuncellene som registrerer patogener via mønstergjenkjenningsreseptorer og fjerner disse patogenene ved fagocytose2. Lungeboende dendrittiske celler bygger bro over den medfødte og adaptive immunresponsen gjennom antigenpresentasjon3. I tillegg produserer aktiverte lokale medfødte immunceller cytokiner og kjemokiner som forsterker den inflammatoriske responsen og stimulerer infiltrasjon av immunceller som monocytter, nøytrofiler og lymfocytter i lungene1. Iskemisk hjerneslag har vist seg å modifisere systemisk immunitet og føre til økt følsomhet for lungeinfeksjon; Imidlertid har få studier evaluert lungekammeret etter iskemisk slag, selv om noen studier har undersøkt det under inflammatoriske tilstander 4,5,6,7,8,9. Målet med metodene beskrevet her er samtidig å bestemme lungepatologi, immuncellesammensetning og nivåene av cytokin og kjemokinuttrykk i lungene for å evaluere endringer i lungekammeret og vurdere potensielle endringer i lungeimmunresponsen etter iskemisk angrep.
Beskrevet her er en protokoll for å oppnå enkeltcellesuspensjoner fra lungene til musene for å identifisere 13 typer immunceller. Denne protokollen er basert på vevsfordøyelse med kollagenase D uten behov for en automatisert vevdissosiator. I tillegg utviklet vi en protokoll for å forberede vevshomogenater som kan brukes til å bestemme ekspresjonsnivåene til 13 forskjellige cytokiner eller kjemokiner ved hjelp av flowcytometribaserte multipleksperlearrayer. Denne protokollen ble vellykket brukt til å undersøke effekten av iskemisk slag på lungeimmunitet og kan også brukes i andre sykdomsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollene beskrevet her tillater identifisering av lungeimmuncelletyper og ekspresjon av kjemokiner eller cytokiner i samme mus. Hvis en histopatologisk studie er ønsket, kan en individuell lobe fjernes og festes for det formålet før du går videre til enkeltcelleisolasjonstrinnene. En begrensning ved denne metoden er at denne tilnærmingen kanskje ikke er egnet i noen sykdomsinnstillinger hvis endringen i immuncellesammensetningen og ekspresjonen av kjemokiner og / eller cytokiner forventes å være ulikt fordelt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend P20 GM109098 og innovasjonsprisprogrammet fra Praespero til Edwin Wan. Flowcytometri-eksperimenter ble utført i WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, som støttes av NIH-tilskudd S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 og P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
