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Biologie

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

Published: May 10, 2020
doi:
10.3791/61364
,
1Department of Molecular Biosciences,The University of Texas at Austin

Summary

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

Abstract

운동성은 많은 세균 종의 생존과 성공에 매우 중요합니다. 많은 방법론이 확산경로를 이해하고, 기조부품의 기능과 어셈블리를 해명하고, 움직임패턴을 조사하고 이해하기 위해 모틸성을 악용하기 위해 존재한다. 여기서 우리는 이러한 방법론의 세 가지 의 조합을 보여줍니다. 연한 한천의 운동성은 가장 오래된 것으로, 운동성 장애균의 기능 형 억제제 돌연변이를 격리하기 위한 강력한 선택을 제공하며, 여기서 운동성 조절은 두 번째 돌연변이를 통해 회복됩니다. 기체 모터의 회전 특성을 입증하기 위해 처음 채택된 셀 테더링 기술은 신호 이펙터가 모터 속도에 미치는 영향과 회전 방향을 전환하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. “국경 횡단”분석은 수영 박테리아가 무리로 집합적으로 이동으로 전환 할 준비가 될 수있는 최신입니다. 이 프로토콜은 함께 운동성 기계의 구성 요소를 식별하고 수영과 무리의 다양한 면에서 자신의 역할을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그(것)들은 그밖 세균성 종에 있는 운동성을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

Introduction

박테리아는 그들의 생태 틈새 시장1에서운동과 분산을 위해 많은 부속물을 사용합니다. Flagella 구동 운동성은 이들 중 가장 빠르며, 환경 신호에 대응하여 유리한 로케일의 식민지화를 촉진하고, 일부 종의 병원성 능력에 크게 기여하고있다2,3. 표기 박테리아는 벌크 액체에서 개별적으로 수영할 수 있으며, 반고체 표면4를통해 집단으로 떼지어질 수 있다. 세포외 기색은 멤브레인에 내장된 회전 모터에 의해 구동되며, 이온 그라데이션의 힘을 이용하여 회전1,2,4,5,6,7,8을유발하는 토크를 생성한다. 모터가 일정한 토크9에서실행되는 대장균에서모터 출력은 시계 반대 방향(CCW)과 시계 방향(CW) 방향으로 회전 속도 및 회전기의 전환 측면에서 분류될 수 있습니다. CCW 회전은 셀을 앞으로 추진하는 일관된 플래그엘라 번들의 형성을 촉진(run), 회전 방향(CW)의 일시적인 스위치는 번들이 부분적으로 또는 완전히10을분해하고, 셀은 수영 방향(tumble)을 재조정하도록 합니다. 대장균은 일반적으로 1초 동안 실행되고 10분의 1초 동안 공중제비합니다. 로터 또는 ‘텀블 바이어스’의 스위칭 주파수는 화학물질 신호 시스템에 의해 제어되며, 여기서 막 이상 화학 수용체는 외부 화학 신호를 감지하고 인포릴레이를 통해 기광모터로 전송하여 유인제에 대한 응답으로 실행을 확장하거나, 독성화학물질(11,12)에대응하여 이를 억제한다. 수영 운동성은 0.3% 부드러운 화창으로 분석됩니다.

무리하는 동안 박테리아는 조밀한 집단으로 반고체 표면을 탐색하며, 박테리아 팩은 연속 소용돌이 동작2,13,14,15로흐를 수 있습니다. 대장균 떼는 화학감각 생리학(낮은 텀블 바이어스), 더 높은 속도, 대량 액체16,17에서수영하는 세포에 대한 항균제에 대한 높은 내성을 나타낸다. Swarmers는 계면 활성제 생산, 과대 깃발 및 세포 연신2를포함하여 운동을 돕는 과다한 전략의 배치에 따라 다릅니다. S워밍업은 생태학적 및임상 설정18,19,20모두에서 박테리아에게 경쟁 우위를 제공합니다. swarmbacteria의 두 가지 범주가 있다: 온대 swarms, 0.5-0.8% 한천으로 고화 된 미디어에만 떼수, 그리고 강력한 swarms, 높은 한천 농도 를 통해 탐색할 수 있는21.

다양한 소의가 수영 운동성과 그 규제를 심문하기 위해 존재합니다. 돌연변이 또는 환경 조건에 의해 손상될 때, 운동성 자체는 기능의 이득 억제기 돌연변이를 확인하기 위한 강한 선택을 제공합니다. 이러한 억제제는 두 번째 돌연변이가 기능을 복원하는 원래 돌연변이 또는 의사 복귀제의 정품 역구일 수 있다. 이러한 돌연변이는 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 의해 식별될 수 있다. 편견없는 억제제 선택에 대한 대안은 편향된 표적 돌연변이 발생 전략(예를 들어, PCR 돌연변이 발생)입니다. 이러한 방법론은 종종 운동성 장치의 기능 또는 환경 조절에 빛을 비추는다. 모터 기능을 연구하는 것이 목표라면, 부드러운 한천에서 측정된 야생형 운동성의 복원이 반드시 야생형 모터 출력의 복원을 나타내는 것은 아닐 수 있습니다. 세포 테더링 분석, 세포가 단일 깃발에 의해 유리 표면에 부착되고 세포 체체의 회전이 이후에 모니터링되는, 모터 거동을 평가하기위한 선택의 초기 분석이 될 수 있습니다. 이제 모터 특성을 모니터링할 수 있는 보다 정교한 방법론이 가능하지만 모션 분석을 위해 필요한 고속 카메라 설정 및 적용으로인해 22,23,24,25의광범위한 사용이 제한됩니다. 셀 테더링 분석법은 기색증을 분리하여 유리 슬라이드에 짧은 필라멘트의 부착을 허용한 다음 셀 바디의 회전을 비디오 녹화해야 합니다. 기록된 모터 속도는 셀 체가 깃음에 미치는 높은 부하 때문에 이 분석에서 낮지만, 그럼에도 불구하고 이 분석은 화학 반응26,27,28,29에대한 귀중한 통찰력에 기여했으며, 아래에서 설명한 바와 같이 유효한 조사 도구로 남아 있다.

모성도를 따뜻하게 하는 것은 연구자에게 다른 도전과제를 제기합니다. 기능의 이득 억제기의 선택은 풍부한 계면 활성제와 쉽게13을생산하는 swarms에서만 작동합니다. 대장균과 같은 계면활성제 비생산자는환경의한천, 미디어 구성 및 습도의 선택에 대하여 까다로운2,13,14,21. 번들 조건이 설정되면, 국경 횡단 분석17은 새로운 / 가혹한 조건을 탐색 하는 군단의 능력을 심문 하는 유용한 방법론. 아래에 제시된 프로토콜은 대장균과관련이 있지만 다른 종의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다.

Protocol

1. 운동성 결핍 균주에서 억제제 돌연변이의 격리 참고: 이 방법을 광범위한 ‘캐치-올’로 사용하여 운동성 결함의 일반적인 특성을 식별합니다. 소프트 마고 플레이트 준비참고: 연골 또는 수영 용으로도 불리는 소프트 에이저는 화학 요법31,32를분석하는 데 오랫동안 사용되었던 낮은 비율의 한천(~0.2-0.35%w/v)?…

Representative Results

그 운동성 신호 분자 c-di-GMP의 높은 수준에 의해 손상되는 대장균 긴장에서 의사 복귀제의 격리는, 우리의 실험실에서 최근 작업에서 상세히 되었다34. 이 균주(JP1442)는 ΔyhjH 및 ΔycgR의두 가지 돌연변이를 수용하였다. YhjH는 대장균에서c-di-GMP를 저하시키는 가장 활동적인 인포디세타이소입니다. YhjH의 부재는 상승 된 c-di-GMP 수준과 운동성의 억제로 이어…

Discussion

억제제 돌연변이의 격리 및 특성화는화학기관시스템(35,36,37)의주요 성분을 식별하는 데 성공적으로 기여했으며, 모터기계자체(38,39,40)를확인하였다. 프로토콜 1을 사용하는 동안, 운동성의 손실을 보상 할 수있는 가능한 돌연변이의 큰 스펙트럼의 격리를 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 건강 보조금 GM118085의 국가 학회에 의해 지원되었고 부분적으로 로버트 웰치 재단 (R.M.H.에 F-1811을 부여)에 의해 지원되었습니다.

Materials

Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe – 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera
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References

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Citer Cet Article
Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).
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