Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks élevés de virus de l’hépatite E de Titer

Summary

Décrit ici est une méthode efficace sur la façon de produire des stocks de trier virale élevé du virus de l’hépatite E (HEV) pour infecter efficacement les cellules hépatomes. Avec la méthode présentée, les particules virales non enveloppées et les particules virales enveloppées peuvent être récoltées et utilisées pour inoculer diverses lignées cellulaires.

Abstract

Le virus de l’hépatite E est la principale cause de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique avec une prévalence croissante dans le monde entier. Le virus de l’ARN à brin unique est principalement transmis par transfusion sanguine, des conditions sanitaires inadéquates et des produits alimentaires contaminés. À ce jour, la ribavirine (RBV) est le traitement de choix pour de nombreux patients. Néanmoins, un traitement spécifique de VHEM reste à identifier. Jusqu’à présent, les connaissances sur le cycle de vie et la pathogénie du VH ont été sérieusement entravées en raison de l’absence d’un système efficace de culture cellulaire HEV. Un système de culture cellulaire robuste est essentiel pour l’étude du cycle de vie viral qui comprend également la pathogénie virale. Avec la méthode décrite ici, on peut produire des titres viraux allant jusqu’à 3 x 10⁶ unité de formation de mise au point /mL (FFU/mL) de HEV non enveloppé et jusqu’à 5 x 10⁴ FFU/mL de HEV enveloppé. En utilisant ces particules, il est possible d’infecter une variété de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et humaines, ainsi que les lignées cellulaires animales. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole extrêmement efficace.

Introduction

L’hépatite E est une maladie assez sous-estimée avec une prévalence croissante dans le monde entier. Environ 20 millions d’infections entraînent plus de 70 000 décès par an¹. L’agent sous-jacent, le virus de l’hépatite E (HEV), a été réaffecté récemment et est maintenant classé dans la famille hepeviridae, y compris les genres Orthohepevirus et Piscihepevirus. HEV de diverses origines sont classés dans l’espèce Orthohèpevirus A-D y compris les isolats de l’homme, porc, lapins, rats, oiseaux et autres mammifères². À l’heure actuelle, huit génotypes différents (GT) du virus de l’ARN à brin unique orienté vers un positif ont été identifiés². Bien qu’ils diffèrent dans leur identité de séquence, les voies de transmission et la répartition géographique, leur structure génomique est fortement conservée. Plus spécifique, le génome hev de 7,2 kbp est divisé en 3 cadres de lecture ouverts majeurs (ORF1-3). Alors que ORF1 code toutes les enzymes nécessaires à une réplication réussie dans la cellule hôte, ORF2 code la protéine capside, et la protéine ORF3 fonctionne comme un canal d’ion fonctionnel requis pour l’assemblage et la libération des particules infectieuses³. Une fois libéré dans le lumen basal ou apical, le VHEM existe chez les deux espèces, quasi-enveloppées et non enveloppées/nues selon que le virus provient du sang ou des excréments, respectivement^4,5.

Alors que gt1 et GT2 se trouvent principalement dans les pays en développement uniquement infecter les humains⁶ par la voie fécale-orale, GT3, GT4 et GT7 se produisent principalement dans les pays développés^1,7 avec une variété d’espèces servant de réservoirs, par exemple, porcs⁸, rat⁹, poulet^10,11, cerf¹², mangouste¹³, chauve-souris¹⁴, lapin^15,16, sanglier¹⁷ et beaucoup plus^7,18,19, fournissant des preuves de zoonose^7,20,21,22. En plus des conditions sanitaires inadéquates²³ et des produits alimentaires contaminés^12,24,25,26, la transmission par transfusion sanguine et transplantations d’organes est également possible^27,28. Le VHEV est une cause fréquente de cirrhose du foie et d’insuffisance hépatique^29, en particulier chez les patients atteints d’une maladie hépatique préexistante, d’immunocompromis (génotype 3, 4 et 7) et de femmes enceintes (génotype 1). A noter, il ya aussi des manifestations extrahépatiques telles que la maladie hématopoïétique^30,31,32, troubles neurologiques³³ et les lésions rénales³⁴.

À ce jour, la ribavirine (RBV) médicament hors étiquette est le traitement de choix pour de nombreux patients infectés^35,36. Cependant, des cas d’échec de traitement et de mauvais résultats cliniques à long terme ont été rapportés. L’échec de traitement a été lié à la mutagénèse virale et à l’hétérogénéité virale accrue dans les patients chroniquement infectés^37,38,39. Au contraire, une étude multicentrique rétrospective européenne récente n’a pas été en mesure de corréler les mutations de la polymérase à l’échec du traitement rbv⁴⁰. Dans les observations cliniques et les expériences in vitro, l’interféron^41,42,43, sofosbuvir^44,45, sels de zinc⁴⁶ et silvestrol^47,48 ont également montré des effets antiviraux. Néanmoins, un traitement spécifique de VH reste à trouver, entravé par le manque de connaissances au sujet du cycle de vie de HEV et de sa pathogénie. Par conséquent, un système robuste de culture cellulaire pour les études virologiques et le développement de nouveaux médicaments antiviraux est nécessaire de toute urgence⁴⁹.

Malheureusement, comme d’autres virus de l’hépatite, le VHE est difficile à propager dans les lignées cellulaires conventionnelles et progresse généralement très lentement, ce qui entraîne de faibles charges virales. Néanmoins, certains groupes ont été en mesure d’augmenter les charges virales par la génération de sous-clones ligne cellulaire⁵⁰ ou l’ajustement des suppléments de médias⁵¹. Récemment, la génération de clones d’ADNC⁵² et l’adaptation des isolats du patient primaire en passant^53,54 encore amélioré propagation HEV dans la culture cellulaire⁵⁵. Dans ce protocole, nous avons utilisé le génome d’une souche Kernow-C1 adaptée à la culture cellulaire (appelée p6_WT)⁵⁴ et d’une souche mutante abritant une mutation améliorant la réplication (appelée p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 est la souche la plus fréquemment utilisée dans la culture cellulaire HEV et est capable de produire des charges virales élevées. En évaluant les numéros de copie virale de l’ARN, la réplication du VH peut être surveillée in vitro. Néanmoins, ces techniques ne permettent pas d’évaluer le nombre de particules infectieuses produites. Par conséquent, nous avons établi une coloration d’immunofluorescence pour déterminer les unités de formation de mise au point (FFU/mL).

La méthode⁵⁶ décrite ici peut être utilisée pour produire des particules virales infectieuses pleine longueur qui sont capables d’infecter une variété de types de cellules d’origines diverses, y compris les cellules primaires et les lignées cellulaires des mammifères. Il s’agit d’une condition préalable fondamentale pour déchiffrer les aspects importants de l’infection et du tropisme de HEV. Il n’y a pas besoin d’inoculation avec des isolats de patient habituellement limités. La production de particules infectieuses de HEV à partir de plasmides pose une source infinie, ce qui rend ce protocole comparablement efficace. En outre, ce système peut être utilisé pour la génétique inverse permettant l’étude de l’altération du génome in vivo identifié et leur impact sur la réplication et la condition physique du VH. Cette technique surmonte de nombreuses limitations et peut suivre la voie pour le développement de médicaments, les études de mutagenesis et l’évaluation des interactions virus-hôte tels que la restriction ou les facteurs d’entrée.

Protocol

REMARQUE : Toutes les expériences sont effectuées sous condition BSL-2. Tous les matériaux qui entrent en contact avec l’ARN du virus de l’hépatite E ou le virus infectieux doivent être rincés correctement avec 4% Kohrsolin FF à partir d’un conteneur de déchets à l’intérieur du capot avant l’élimination. 1. Préparation plasmide Inoculer un milieu de 200 mL LB contenant une ampicilline de 100 μg/mL avec une apéricile Escherichia coli JM109 transformée…

Representative Results

Dans ce protocole, nous décrivons la production de HEVcc infectieux à haute teneur en titer. La première étape consiste à isoler l’ADN plasmide (pBluescript_SK_HEVp654 et pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figure 8a), qui est ensuite linéaire par digestion de restriction et purifié pour la transcription in vitro (Figure 1). Une linéarisation réussie peut être vérifiée en comparant l’ADN plasmide non dig…

Discussion

En commençant par la préparation du plasmide, les rendements de l’ADN devraient dépasser 150 ng/μL pour être en mesure d’effectuer une linéarisation multiple à partir du même stock de plasmide, ce qui minimise le risque de mutagenèse induite par les bactéries des séquences génomiques cruciales. En outre, il est important de vérifier la digestion de restriction pour la linéarisation complète du plasmide par électrophorèse de gel (figure 8b). Un manque d’ADN plasmide lin…

Materials

0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Harvest extracellular Virus
4 % Histofix	CarlRoth	P087.4	Immunofluorescence
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	Collagen working solution
Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910024	Virus harvesting
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	Selection of transformed bacteria
ATP	Roche	11140965001	in vitro transcription and electroporation
BioRender	BioRender		Figure Generation
CaCl2	Roth	5239.2	Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Collagen working solution
CTP	Roche	11140922001	in vitro transcription
Cuvette	Biorad	165-2088	Electroporation
DAPI	Invitrogen	D21490	Immunofluorescence
DMEM	gibco	41965-039	Cell culture
DNAse	Promega	M6101	in vitro transcription
DTT	Promega	included in P2077	in vitro transcription
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
Escherichia coli JM109	Promega	L2005	Transformation
Fetal bovine serum	gibco	10270106	Cell culture
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01	Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Electroporation
Gentamycin	gibco	15710049	Cell culture
GTP	Roche	11140957001	in vitro transcription
H2O	Braun	184238001	Immunofluorescence
Hepes	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Horse serum	gibco	16050122	Immunofluorescence
K2HPO4	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
KH2PO4	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Cell culture
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cell culture
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cell culture
MgCl2	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA concentration
MluI enzyme	NEB	R0198L	Linearization
NEB buffer	NEB	included in R0198L	Linearization
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey & Nagel	740588.250	Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit	Macherey & Nagel	740948.250	RNA purification
PBS	gibco	70011051	Cell culture
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)	Todt et.al		Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)	Shukla et al.	GenBank accession no. JQ679013	Virus production
Primary antibody 1E6	LS-Bio	C67675	Immunofluorescence
Primary antibody 8282			Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog	Promega	P1711	in vitro transcription
RNase away	CarlRoth	A998.3	RNA purification
RNasin (RNase inhibitor)	Promega	N2515	in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488	Thermo Fisher	A-21202	Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488	Thermo Fisher	A-11008	Immunofluorescence
Sodium Pyruvat	gibco	11360070	Cell culture
T7 RNA polymerase	Promega	P2077	in vitro transcription
Transcription Buffer	Promega	included in P2077	in vitro transcription
Triton X-100	CarlRoth	3051.3	Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Cell culture
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Cell culture
UTP	Roche	11140949001	in vitro transcription