높은 티더 E 바이러스 주식을 생산하기위한 세포 배양 모델
Summary
여기에 설명된 이종세포를 효율적으로 감염시키기 위해 E형 간염 바이러스(HEV)의 높은 바이러스 성 티터 스톡을 생성하는 방법에 대한 효과적인 방법이 기재되어 있다. 제시된 방법을 통해, 비봉투뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스 성 입자를 모두 수확하고 다양한 세포주를 접종하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
E형 간염 바이러스는 전 세계적으로 증가하는 보급과 간 간 경변및 간 부전의 주요 원인입니다. 단일 좌초 RNA 바이러스는 주로 수혈, 부적절한 위생 조건 및 오염된 식품에 의해 전달됩니다. 현재까지 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 환자를위한 선택의 치료입니다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 확인 될 남아. 지금까지 HEV 수명 주기 및 병인에 대한 지식은 효율적인 HEV 세포 배양 시스템의 부족으로 인해 심각하게 방해받고 있습니다. 강력한 세포 배양 시스템은 또한 바이러스성 병인을 포함하는 바이러스성 생활 주기의 연구 결과에 필수적입니다. 여기에 설명된 방법을 통해 최대 3 x 106 초점 성형 장치/mL(FFU/mL)의 바이러스 성 티터를 생성할 수 있으며, 봉투에 싸인 HEV의 최대 5 x 104 FFU/mL을 생성할 수 있다. 이러한 입자를 이용하여, 동물 세포주뿐만 아니라 1차 세포 및 인간을 포함한 다양한 기원의 세포를 감염시킬 수 있다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 제기, 이는이 프로토콜을 매우 효율적으로.
Introduction
E형 간염은 전 세계적으로 보급이 증가하는 상당히 과소 평가된 질병입니다. 대략 2천만 개의 감염은1년에70,000의 죽음 귀착됩니다. 기본 에이전트, E형 간염 바이러스 (HEV), 최근에 재할당되고 지금 제네라 Orthohepevirus 및 Piscihepevirus를 포함하여 가족 Hepeviridae 안에 분류됩니다. 다양한 기원의 HEV는 인간, 돼지, 토끼, 쥐, 조류 및 기타 포유동물2로부터분리된 것을 포함하여 종 오르토헤페바이러스 A-D 종 내에서 분류된다. 현재, 양성 지향성, 단일 좌초 RNA 바이러스의 8가지 상이한 유전자형(GT)이2로확인되었다. 그들은 그들의 순서 정체성, 전송 경로 및 지리적 분포에서 다르지만, 그들의 게놈 구조는 높게 보존됩니다. 보다 구체적으로, 7.2 kbp HEV 게놈은 3개의 주요 개방 판독 프레임(ORF1-3)으로 나뉩니다. ORF1은 숙주 세포 내에서 성공적인 복제에 필요한 모든 효소를 인코딩하는 동안, ORF2는 캡시드 단백질을 인코딩하고, ORF3 단백질은 전염성 입자의 조립 및 방출에 필요한 기능성 이온 채널로작동한다 3. 일단 기저 또는 어형 루멘 HEV에 방출되면 바이러스가 혈액 또는 대변에서 유래하는지 여부에 따라 준 봉투 및 비 봉투 / 벌거 벗은 종, 각각4,,5에존재한다.
GT1과 GT2는 주로 개발 도상국에서 발견 되 고 만 인간을,감염6 배설물 구두 경로 통해, GT3, GT4 및 GT7은 주로 선진국 에서 발생,71,,7 저수지로 봉사 하는 종의 다양한, 예를 들어, 돼지8,쥐9,닭10,,11,사슴12,몽구스13,박쥐14,토끼15,,16,야생 멧돼지17 그리고 더 많은7,,18,,19,동물원의 증거를제공,20, 20.2122 부적절한 위생조건(23)과 오염된식품(12,,24,,,25,26)이외에 수혈 및 장기 이식을 통한 전송도27,,28로가능하다. HEV는 간경변과 간 부전의 일반적인원인(특히 기존 간질환 환자, 면역손상형 3, 4, 7) 및 임산부(유전자형 1)를 가진 환자에서 특히 있다. ,참고로, 조혈질환(30,30,31,32)신경장애(33) 및신장손상(34)과같은 외형증상도 있다.
현재까지, 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 감염된 환자에 대한 선택의치료입니다 35,,36. 그러나, 치료 실패와 가난한 임상 장기 결과의 경우 보고 되었습니다. 치료 실패는 만성 감염 환자에서 바이러스 돌연변이 발생 및 증가 된 바이러스 성 이질성에 연결되었습니다37,,38,,39. 반대로, 최근 유럽의 회고전 다중센터 연구는 중합효소 돌연변이를 RBV 치료실패(40)와상관연관시킬 수 없었다. 임상 관찰 및 체외 실험에서 인터페론41,,42,,43,소파부비르44,,45,아연 염46 및 실베스트롤47,,48도 항바이러스 효과를 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 발견 될 남아, HEV 라이프 사이클및 그것의 병인에 대 한 지식의 부족에 의해 방해. 따라서, 바이러스학 연구 및 새로운 항바이러스 약물의 개발을 위한 견고한 세포 배양 시스템이 절실히 필요하다49.
불행히도, 다른 간염 바이러스와 마찬가지로 HEV는 기존의 세포주에서 전파하기가 어렵고 일반적으로 바이러스 부하가 적기 때문에 매우 느리게 진행됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 일부 그룹 셀 주 subclones의 생성에 의해 바이러스 부하를 높일 수 있었다50 또는 미디어 보충제의 조정51. 최근에는 cDNA클론(52)의 생성과 1차 환자의 적응이53,,54로 세포배양에서HEV 전파를 더욱 개선하여 분리한다. 본 프로토콜에서, 우리는 Kernow-C1 균주(p6_WT라고 함)및 복제 강화 돌연변이(p6_G1634R라고 함)를 수용하는 돌연변이 균주(p6_G1634R)를 적응한 세포 배양의 게놈을 사용했다.37 Kernow-C1은 HEV 세포 배양에서 가장 자주 사용되는 변형이며 높은 바이러스 부하를 생성 할 수 있습니다. 바이러스 RNA 복사 번호를 평가함으로써 HEV 복제를 시험관 내에서 모니터링할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 기술은 생성되는 전염성 입자의 수의 평가를 허용하지 않습니다. 따라서, 우리는 초점 성형 단위 (FFU/mL)를 결정하기 위하여 면역 형광 염색을 설치했습니다.
본 설명된방법(56)은 1차 세포 및 포유류 세포주를 포함한 다양한 기원으로부터 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있는 전신 전염성 바이러스 입자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이것은 HEV 감염과 트로피주의의 중요한 측면을 해독하기 위한 근본적인 전제 조건입니다. 일반적으로 제한된 환자 격리를 가진 접종을 위한 필요가 없습니다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 포즈, 이 프로토콜을 비교적 효율적으로. 또한, 이 시스템은 생체 내에서 확인된 게놈 변경 및 HEV 복제 및 적합성에 미치는 영향을 연구가능하게 하는 역유전학에 사용될 수 있다. 이 기술은 많은 한계를 극복하고, 약물 개발, 돌연변이 발생 연구 및 제한 또는 진입 요인과 같은 바이러스 호스트 상호 작용의 평가를 위한 길을 길수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
플라스미드 제제를 시작으로, DNA 수율은 150 ng/μL을 초과하여 동일한 플라스미드 스톡에서 다중 선형화를 수행할 수 있어야 하며, 이는 중요한 게놈 서열의 박테리아 유발 돌연변이 발생 위험을 최소화합니다. 더욱이, 겔 전기포에 의한 완전한 플라스미드 선형화에 대한 제한 다이제스트를 확인하는 것이중요하다(도 8b). 선형화된 플라스미드 DNA의 부족은 생체 외 전사가 덜 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 E형 간염 바이러스 p6 클론에 대한 수잔 에머슨에 감사드립니다. HEV 특이토끼 하이퍼면역 혈청은 독일 프리드리히 로플러 연구소인 라이너 울리히(Rainer Ulrich)가 친절하게 제공했습니다. 또한, 우리는 그들의 지원과 토론에 대한 루르 대학 보훔에서 분자 및 의학 바이러스학과의 모든 구성원에게 감사드립니다. 도 1-7은 BioRender.com 생성되었다.
Materials
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
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