التصور الحركي لتفاعلات البكتيريا بين الخلايا المفردة
Summary
يسمح بروتوكول تصوير الخلايا البكتيرية الحية هذا بالتصور للتفاعلات بين أنواع بكتيرية متعددة على مستوى الخلية الواحدة بمرور الوقت. يسمح التصوير الفاصل الزمني بمراقبة كل نوع بكتيري في زراعة أحادية أو تربية نقّاء لاستجواب التفاعلات بين الأنواع في المجتمعات الجرثومية متعددة الأنواع، بما في ذلك حركية الخلايا الفردية وقابلية البقاء.
Abstract
المجتمعات متعددة الميكروبات في كل مكان في الطبيعة، ولكن دراسة تفاعلاتها على مستوى الخلية الواحدة أمر صعب. وهكذا، تم تطوير طريقة تستند إلى المجهر لمراقبة التفاعلات بين الأنواع بين اثنين من مسببات الأمراض البكتيرية. استخدام هذه الطريقة لاستجواب التفاعلات بين مسببات المرض الغرام السالبة، Pseudomonas aeruginosa وغير motile الغرام إيجابية الممرض، هو موضح هنا. يتكون هذا البروتوكول من التلقيح المشترك لكل نوع بين غطاء ومنصة agarose ، والتي تحافظ على الخلايا في مستوى واحد ويسمح بالتصور من السلوكيات البكتيرية في كل من المكان والزمان.
وعلاوة على ذلك، فإن المجهر الفاصل الزمني الذي يظهر هنا مثالي لتصور التفاعلات المبكرة التي تحدث بين نوعين أو أكثر من الأنواع البكتيرية، بما في ذلك التغيرات في حركة الأنواع البكتيرية في الزراعة الأحادية وتربية الأحياء مع الأنواع الأخرى. نظرا لطبيعة مساحة العينة المحدودة في إعداد المجهر، وهذا البروتوكول هو أقل قابلية للتطبيق لدراسة التفاعلات في وقت لاحق بين الأنواع البكتيرية مرة واحدة في مجموعات الخلايا مرتفعة جدا. ومع ذلك ، هناك العديد من التطبيقات المختلفة للبروتوكول والتي تشمل استخدام تلطيخ لتصوير الخلايا البكتيرية الحية والميتة ، وتحديد كمي من الجينات أو البروتين التعبير من خلال المراسلين الفلورسنت ، وتتبع حركة الخلايا البكتيرية في كل من الأنواع الفردية وتجارب متعددة الأنواع.
Introduction
المجتمعات متعددة الميكروبات شائعة في الطبيعة، وتمتد على مجموعة متنوعة من البيئية1و2و3 و المنافذ البشرية4،5. بعض من التهابات بوليكروبات الأكثر شهرة في الأمراض البشرية وتشمل الأغشية الحيوية الأسنان6, الجروح المزمنة7,8, والتهابات الجهاز التنفسي في الأفراد الذين يعانون من مرض الانسداد الرئوي المزمن9, التنفس الصناعي المرتبطة الالتهاب الرئوي10, والتليف الكيسي المرض الوراثي (CF)11,12. وغالبا ما تتكون هذه العدوى من أنواع ميكروبية متنوعة. ومع ذلك، فقد برز تركيز حديث على التفاعلات بين البكتيريا المكورات العنقودية الأوريوسية الإيجابية للجرام وبكتيريا Pseudomonas aeruginosa السلبية للجرام. وتكشف الدراسات التي تشمل المرضى المصابين بهذه الكائنات الحية والتحليلات المختبرية عن التفاعلات التنافسية والتعاونية التي يمكن أن يكون لها تأثيرات عميقة وغير متوقعة على تطور المرض، والبقاء على قيد الحياة الميكروبي، والفوعة، والتمثيل الغذائي، وقابلية المضادات الحيوية (استعرضت بالتفصيل من قبل ثيرتبيكيكس وآخرون 201713 وليمولي وهوفمان 20193).
وقد أدى الاهتمام المتزايد في التفاعلات بين الأنواع أثناء العدوى إلى مجموعة متنوعة من الطرق لدراسة سلوكيات المجتمع متعدد الميكروبات. عادة، استخدمت هذه الدراسات الوحايس القائمة على لوحة أو مرق للتحقيق في الاختلافات الظاهري بين الزراعة الأحادية وتربية التكث. على سبيل المثال، coculturing P. aeruginosa وS. aureus على الأسطح الصلبة سمحت للتصور من تثبيط النمو أو التغيرات في النمط الظاهري مستعمرة، الصباغ، أو إنتاج السكريات14،15،16. الأنواع الحيوية المختلطة، على الأسطح الحيوية أو اللاأحيائية، وكذلك الأنواع البكتيرية coculturing في الثقافة السائلة كما مكن قياس التغيرات في النمو، والتمثيل الغذائي، والتسامح المضادات الحيوية، والمنافسة والاستمرارية، بالإضافة إلى الجينات والبروتين التعبير17،18. في حين كشفت هذه التجارب الثقافة السائبة نظرة ثاقبة كيف P. aeruginosa وS. aureus قد تؤثر على بعضها البعض على نطاق المجتمع, أنها غير قادرة على الإجابة على أسئلة هامة حول التفاعلات التي تحدث على مستوى خلية واحدة. الأسلوب المعروض هنا يضيف إلى نهج لدراسة التفاعلات بين الأنواع من خلال التركيز على التغيرات في الحركة، وقابلية الخلية للحياة، والتعبير الجيني للخلايا الفردية داخل مجتمع مشترك مع مرور الوقت.
يمكن أن تختلف التفاعلات أحادية الخلية بشكل كبير عن التفاعلات التي تحدث في مجتمع الخلايا السائبة. ومن خلال التحليل أحادي الخلية، يمكن قياس التغايرية داخل المجتمع المحلي كمياً لدراسة كيفية تأثير الموضع المكاني للخلايا على ديناميات المجتمع المحلي أو كيف تتغير مستويات التعبير الجيني والبروتيني داخل فرادى أعضاء المجموعة. يمكن أن توفر خلايا التتبع أيضًا نظرة ثاقبة على كيفية تحرك الخلايا الفردية وسلوكها بمرور الوقت ، من خلال أجيال متعددة. من خلال تتبع حركة الخلايا والتغيرات في التعبير الجيني في وقت واحد، يمكن إجراء الارتباطات بين تقلبات الجينات والأنماط الظاهرية المقابلة. وقد تم وصف البروتوكولات السابقة لدراسة الأنواع البكتيرية الفردية على مستوى الخلية الواحدة. هذه الدراسات الاستفادة من خلايا التصوير الحي مع مرور الوقت في مستوى واحد، وكانت مفيدة لمراقبة الأنماط الظاهرية مثل انقسام الخلايا والمضادات الحيوية التعرض19,20. وقد استخدمت إضافية المجهر التصوير الحي لرصد النمو، والحركة، واستعممار السطح وتشكيل بيو فيلم من الأنواع البكتيرية واحدة21،22،23. ومع ذلك ، في حين أن هذه الدراسات كانت ثاقبة لفهم فسيولوجيا البكتيريا في الزراعة الأحادية ، فإن تجارب مراقبة سلوك الخلايا الواحدة لأنواع بكتيرية متعددة مع مرور الوقت في الزراعة المشتركة محدودة.
هنا، تم تكييف البروتوكولات السابقة المستخدمة للتصوير من نوع واحد لدراسة التفاعلات بين P. aeruginosa وS. aureus. ويمكن تمييز هذه الكائنات تحت النقيض من المرحلة على أساس morphologies الخلية(P. aeruginosa هي عصيات وS. aureus هي cocci). تطوير هذا الأسلوب مؤخرا تمكين التصور من السلوكيات الحركة غير الموصوفة سابقا من P. aeruginosa في وجود S. aureus24. P. aeruginosa وجد أن تكون قادرة على استشعار S. aureus من مسافة بعيدة والاستجابة مع زيادة واتجاه حركات خلية واحدة نحو مجموعات من الخلايا S. aureus. P. aeruginosa الحركة نحو S. aureus وجدت أن تتطلب نوع الرابع بيلي (TFP), الشعر مثل التوقعات التي تمديد منسقة والتراجع توليد حركة تسمى الارتعاش25حركة .
وتبين هذه الدراسات فائدة هذه الطريقة لاستجواب التفاعلات السابقة بين الأنواع. ومع ذلك، فإن التصوير بكثافة الخلايا العالية عند نقاط وقت التفاعل اللاحقة أمر صعب بالنظر إلى أنه لم يعد من الممكن تحديد طبقات واحدة من الخلايا، مما يطرح في الغالب مشكلات أثناء تحليل ما بعد التصوير. وبالنظر إلى هذا القيد، فإن الطريقة هي الأنسب للتفاعلات في وقت سابق التي يمكن بعد ذلك متابعة مع المقايسات العيانية التقليدية في أعلى كثافات الخلية ممثلة للتفاعلات في وقت لاحق. وتشمل القيود الإضافية لهذه الطريقة طبيعة منخفضة الإنتاجية، حيث يمكن تصوير عينة واحدة فقط في كل مرة وتكلفة المجهر والكاميرا وغرفة البيئة. وعلاوة على ذلك، يشكل المجهر الفلوري مخاطر على الخلايا البكتيرية مثل السمية الضوئية وphotobleaching، وبالتالي الحد من التردد الذي يمكن الحصول على الصور الفلورية. وأخيراً، فإن منصات الأاغروز المستخدمة في هذه الطريقة معرضة بشدة للتغيرات في البيئة، مما يجعل من الأهمية بمكان التحكم في ظروف مثل درجة الحرارة والرطوبة، بالنظر إلى أن الوسادات يمكن أن تبدأ في الانكماش أو التوسع إذا كانت الظروف غير صحيحة. وأخيراً، في حين أن هذه الطريقة لا تحاكي البيئة المضيفة، إلا أنها توفر أدلة حول كيفية استجابة الأنواع البكتيرية المختلفة على الأسطح، والتي يمكن متابعتها في مقايسات مصممة لمحاكاة الظروف البيئية/المضيفة.
هذه الطريقة تختلف عن الدراسات السابقة تتبع حركة الخلية المفردة، في أن يتم تلقيح الخلايا بين غطاء و لوحة agarose، تقييد الخلايا إلى السطح. وهذا يتيح تتبع الخلايا عبر الوقت في مستوى واحد; ومع ذلك، يحد من دورات الاشتباك السطحي العابر لوحظ عندما يتم غمر الخلايا في السائل26. فائدة إضافية من البكتيريا التصوير تحت لوحة agarose هو أنه يحاكي المجهرية لوحة على أساس اختبار تحت السطح يستخدم كلاسيكيا لفحص P. aeruginosa ارتعاش25حركة . في هذا الفحص ، يتم تلقيح الخلايا البكتيرية بين الجزء السفلي من طبق بيتري والأجار ، مع الحفاظ على الخلايا في مستوى واحد أثناء تحركها عبر الجزء السفلي من الطبق إلى الخارج من نقطة التطعيم ، مثل بروتوكول المجهر هذا.
بروتوكول المجهر الفاصل الزمني لتصور التفاعلات بين الأنواع المعروضة هنا يتكون من 1) إعداد عينة بكتيرية و وسادة agarose، 2) اختيار إعدادات المجهر للحصول على التصوير و 3) بعد التصوير التحليل. ويمكن تنفيذ تصور مفصل لحركة الخلية وتتبعها عن طريق الحصول على الصور على فترات زمنية قصيرة من قبل النقيض من المرحلة. ويمكن أيضا أن تستخدم المجهر الفلوريس لتحديد صلاحية الخلية أو التعبير الجيني مع مرور الوقت. هنا، نعرض مثالاً واحداً على التكيف مع المجهر المفلور من خلال إضافة الأصباغ الصالحة للحياة إلى منصات agarose.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف الأساليب المعروضة هنا بروتوكولاً للتصوير بالخلايا الحية لتفاعلات الأنواع البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة مع تعديلات لتطبيقات أخرى بما في ذلك تتبع الخلايا ومراقبة صلاحية الخلايا. هذه الطريقة تفتح آفاقا جديدة لدراسة السلوكيات وحيدة الخلية من الكائنات الحية الدقيقة في تربية الأحي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة التليف الكيسي ما بعد الدكتوراه إلى كلية انتقال جائزة ليمولي18F5 (DHL)، والتليف الكيسي مؤسسة صغار أعضاء هيئة التدريس جائزة التوظيف LIMOLI19R3 (DHL)، وNIH T32 منحة التدريب 5T32HL007638-34 (ASP). نشكر جيفري مايسنر، مينسو كيم، وإيثان غارنر على مشاركة البروتوكولات الأولية والمشورة للتصوير وصنع منصات.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
