Kinetisk visualisering af encellede interarts bakterielle interaktioner
Summary
Denne levende bakterielle cellebilleddannelse protokol giver mulighed for visualisering af interaktioner mellem flere bakteriearter på encellet niveau over tid. Time-lapse imaging giver mulighed for observation af hver bakterieart i monokultur eller coculture at afhøre interspecies interaktioner i multispecies bakterielle samfund, herunder individuelle celle motilitet og levedygtighed.
Abstract
Polymikrobielle samfund er allestedsnærværende i naturen, men at studere deres interaktioner på encellet niveau er vanskelig. Der er således udviklet en mikroskopibaseret metode til observation af interspecies-interaktioner mellem to bakteriepatogener. Brugen af denne metode til at afhøre interaktioner mellem en motile Gram-negative patogen, Pseudomonas aeruginosa og en ikke-motile Gram-positive patogen, Staphylococcus aureus er påvist her. Denne protokol består af co-inoculating hver art mellem en coverslip og en agarose pad, som fastholder cellerne i et enkelt plan og giver mulighed for visualisering af bakteriel adfærd i både rum og tid.
Desuden er den time-lapse mikroskopi demonstreret her ideel til at visualisere de tidlige interaktioner, der finder sted mellem to eller flere bakteriearter, herunder ændringer i bakteriearter motilitet i monokultur og i coculture med andre arter. På grund af karakteren af den begrænsede prøveplads i mikroskopiopsætningen er denne protokol mindre anvendelig til at studere senere interaktioner mellem bakteriearter, når cellepopulationerne er for høje. Men der er flere forskellige anvendelser af protokollen, som omfatter brugen af farvning til billeddannelse levende og døde bakterieceller, kvantificering af gen- eller proteinudtryk gennem fluorescerende journalister, og sporing bakteriel cellebevægelse i både enkelt art og multispecies eksperimenter.
Introduction
Polymikrobielle samfund er almindelige i naturen, der spænder over en rækkemiljømæssige 1,2,3 og menneskelige nicher4,5. Nogle af de mest berygtede polymikrobielle infektioner i sygdomme hos mennesker omfatter dental biofilm6, kroniskesår 7,8, og luftvejsinfektioner hos personer med kronisk obstruktiv lungesygdom9, ventilator-associeret lungebetændelse10, og den genetiske sygdom cystisk fibrose (CF)11,12. Disse infektioner er ofte sammensat af forskellige mikrobielle arter; men, en nylig fokus på samspillet mellem Gram-positive bakterien Staphylococcus aureus og Gram-negative bakterien Pseudomonas aeruginosa er opstået. Undersøgelser, der omfatter patienter, der er inficeret med disse organismer og in vitro-analyser, afslører både konkurrencedygtige og kooperative interaktioner, der kan have dybtgående og uventede påvirkninger af sygdomsprogression, mikrobiel overlevelse, virulens, stofskifte og antibiotikamodtagelighed (gennemgået i detaljer af Hotterbeekx et al. 201713 og Limoli og Hoffman 20193).
Den stigende interesse for interspecies interaktioner under infektion har givet en række metoder til at studere polymikrobielle samfund adfærd. Typisk har disse undersøgelser udnyttet plade eller bouillon-baserede analyser til at undersøge fæotypiske forskelle mellem monokultur og coculture. For eksempel har coculturing P. aeruginosa og S. aureus på faste overflader gjort det muligt at visualisere væksthæmning eller ændringer i kolonifætype, pigment eller polysaccharidproduktion14,15,16. Biofilm af blandede arter, på biotiske eller abiotiske overflader samt coculturing bakteriearter i flydende kultur har også gjort det muligt at måle ændringer i vækst, stofskifte, antibiotikatolerance, konkurrence og levedygtighed, ud over gene og protein udtryk17,18. Mens disse bulk kultur eksperimenter har afsløret indsigt i, hvordan P. aeruginosa og S. aureus kan påvirke hinanden på community-skalaen, de er ude af stand til at besvare vigtige spørgsmål om de interaktioner, der finder sted på encellet niveau. Den metode, der præsenteres her, bidrager til tilgangene til at studere interspecies interaktioner ved at fokusere på ændringer i bevægelse, celle levedygtighed, og genekspression af enkelte celler i en cocultured samfund over tid.
Single-celle interaktioner kan i vid udstrækning afvige fra de interaktioner, der finder sted i en bulk samfund af celler. Gennem encelleanalyse kan heterogenitet i et samfund kvantificeres for at undersøge, hvordan rumlig placering af celler påvirker samfundets dynamik, eller hvordan gen- og proteinudfoldelsesniveauer ændrer sig hos de enkelte medlemmer af en gruppe. Sporing af celler kan også give indsigt i, hvordan enkelte celler bevæger sig og opfører sig over tid gennem flere generationer. Ved at spore cellebevægelser og ændringer i genekspression samtidig kan der foretages korrelationer mellem genudsving og tilsvarende fænotyper. Tidligere protokoller for undersøgelse af individuelle bakteriearter på encelleniveau er blevet beskrevet. Disse undersøgelser drage fordel af live-imaging celler over tid i et enkelt plan, og har været nyttige til at observere fænotyper som celledeling og antibiotika modtagelighed19,20. Yderligere levende-imaging mikroskopi er blevet udnyttet til at overvåge vækst, motilitet, overflade kolonisering og biofilm dannelse af enkelt bakteriearter21,,22,23. Men mens disse undersøgelser har været indsigtsfulde for at forstå fysiologi af bakterier i monokultur, eksperimenter for at observere encellede adfærd af flere bakteriearter over tid i coculture er begrænset.
Her er tidligere protokoller, der anvendes til billeddannelse af en enkelt art, blevet tilpasset til at undersøge interaktioner mellem P. aeruginosa og S. aureus. Disse organismer kan differentieres under fasekontrast baseret på deres cellemorfologi (P. aeruginosa er bacilli og S. aureus er cocci). Udvikling af denne metode for nylig aktiveret visualisering af tidligere ubeskrevet motilitet adfærd P. aeruginosa i overværelse af S. aureus24. P. aeruginosa viste sig at være i stand til at føle S. aureus på afstand og reagere med øgede og retningsbestemte encellede bevægelser mod klynger af S. aureus celler. P. aeruginosa bevægelse mod S. aureus blev anset for at kræve den type IV pili (TFP), hår-lignende fremskrivninger, hvis koordinerede udvidelse og tilbagetrækning generere en bevægelse kaldet trækninger motilitet25.
Disse undersøgelser viser nytten af denne metode til afhøring af tidligere interaktioner mellem arter. Billeddannelse ved høje celletætheder ved senere interaktionspunkter er imidlertid vanskelig, da enkelte lag af celler ikke længere kan identificeres, hvilket for det meste giver problemer under analyse efter billeddannelse. I betragtning af denne begrænsning, metoden er bedst egnet til tidligere interaktioner, som derefter kunne følges op med traditionelle makroskopiske analyser ved højere celletætheder repræsentativ for senere interaktioner. Yderligere begrænsninger af denne metode omfatter lav-throughput karakter, da kun én prøve kan afbildes ad gangen, og omkostningerne ved mikroskop, kamera og miljøkammer. Desuden fluorescensmikroskopi udgør en risiko for bakterieceller som fototoksicitet og fotobleaching, hvilket begrænser hyppigheden af fluorescensbilleder kan erhverves. Endelig er de agarosepuder, der anvendes i denne metode, meget modtagelige for ændringer i miljøet, hvilket gør det afgørende at kontrollere for forhold som temperatur og fugtighed, da puderne kan begynde at skrumpe eller udvide, hvis betingelserne ikke er korrekte. Endelig, mens denne metode ikke efterligner værtsmiljøet, det giver fingerpeg om, hvordan forskellige bakteriearter reagere på overflader, som kan følges op i analyser designet til at efterligne miljø / vært betingelser.
Denne metode adskiller sig fra tidligere undersøgelser sporing enkeltcellebevægelse, i, at celler er podet mellem en coverslip og agarose pad, begrænse celler til overfladen. Dette muliggør cellesporing over tid i et enkelt plan. begrænser dog cyklusser af forbigående overfladeengagement observeret, når cellerne nedsænkes i væske26. En yderligere fordel ved billeddannelse bakterier under en agarose pad er, at det efterligner makroskopisk plade-baserede sub-overflade vaccination assays klassisk anvendes til at undersøge P. aeruginosa trækninger motilitet25. I denne analyse podes bakterieceller mellem bunden af en petriskål og agaren, hvilket holder cellerne i et enkelt plan, når de bevæger sig hen over bunden af skålen udad fra vaccinationspunktet, ligesom denne mikroskopiprotokol.
Den tidsforskænde mikroskopiprotokol til visualisering af interartinteraktioner, der præsenteres her, består af 1) forberedelse af bakterieprøven og agarosepuden, 2) valg af mikroskopindstillinger for billeddannelse og 3) post-imaging analyse. Detaljeret visualisering af cellebevægelse og -sporing kan udføres ved erhvervelse af billeder med korte tidsintervaller efter fasekontrast. Fluorescensmikroskopi kan også anvendes til at bestemme celle levedygtighed eller genekspression over tid. Her viser vi et eksempel på tilpasning til fluorescensmikroskopi ved tilsætning af levedygtighedsfarvestoffer til agarosepuderne.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder, der præsenteres her, beskriver en protokol for livecellebilleddannelse af bakteriearters interaktioner på encelleniveau med modifikationer til andre anvendelser, herunder cellesporing og overvågning af cellernes levedygtighed. Denne metode åbner nye muligheder for at studere encellede adfærd mikroorganismer i coculture med andre arter over tid. Specifikt, protokollen viser nytten af denne coculture metode til at observere bakteriel overflade adfærd, især når man studerer organismer, der har både over…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Cystisk Fibrose Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystisk Fibrose Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), og NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Vi takker Jeffrey Meisner, Minsu Kim og Ethan Garner for at dele indledende protokoller og råd til billedbehandling og gøre puder.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
