Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires
Summary
Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.
Abstract
Les communautés polymicrobiales sont omniprésentes dans la nature, mais il est difficile d’étudier leurs interactions au niveau unicellulaire. Ainsi, une méthode basée sur la microscopie a été développée pour observer les interactions inter-espèces entre deux pathogènes bactériens. L’utilisation de cette méthode pour interroger les interactions entre un pathogène gramnégatif motile, Pseudomonas aeruginosa et un pathogène gram-positif non-motile, Staphylococcus aureus est démontrée ici. Ce protocole consiste à co-inoculer chaque espèce entre un couvercle et un tampon agarose, qui maintient les cellules dans un seul plan et permet la visualisation des comportements bactériens dans l’espace et le temps.
En outre, la microscopie en time-lapse démontrée ici est idéale pour visualiser les premières interactions qui ont lieu entre deux espèces bactériennes ou plus, y compris les changements dans la motilité des espèces bactériennes en monoculture et en coculture avec d’autres espèces. En raison de la nature de l’espace d’échantillonnage limité dans la configuration de la microscopie, ce protocole est moins applicable pour étudier les interactions ultérieures entre les espèces bactériennes une fois que les populations cellulaires sont trop élevées. Cependant, il existe plusieurs applications différentes du protocole qui comprennent l’utilisation de la coloration pour l’imagerie des cellules bactériennes vivantes et mortes, la quantification de l’expression des gènes ou des protéines par le biais de reporters fluorescents, et le suivi du mouvement des cellules bactériennes dans les deux espèces individuelles et des expériences multi-espèces.
Introduction
Les communautés polymicrobiales sont communes dans la nature, couvrant une variété del’environnement 1,,2,3 et les niches humaines4,5. Certaines des infections polymicrobiales les plus notoires dans la maladie humaine incluent les biofilms dentaires6, les blessures chroniques7,8, et les infections respiratoires chez les personnes atteintes de la maladie pulmonaire obstructive chronique9, pneumonie contamile associée à ventilateur10, et la mucoviscidose de la maladie génétique (CF)11,12. Ces infections sont souvent composées de diverses espèces microbiennes; cependant, un accent récent sur les interactions entre la bactérie Gram-positive Staphylococcus aureus et la bactérie gram-négative Pseudomonas aeruginosa a émergé. Des études comprenant des patients atteints de ces organismes et des analyses in vitro révèlent des interactions compétitives et coopératives qui peuvent avoir des influences profondes et inattendues sur la progression de la maladie, la survie microbienne, la virulence, le métabolisme et la susceptibilité aux antibiotiques (revues en détail par Hotterbeekx et al.2017 13 et Limoli et Hoffman 20193).
L’intérêt croissant pour les interactions inter-espèces pendant l’infection a donné lieu à une variété de méthodes pour étudier les comportements communautaires polymicrobaires. Typiquement, ces études ont utilisé des essais à base de plaque ou de bouillon pour étudier les différences phénotypiques entre la monoculture et la coculture. Par exemple, la coculture P. aeruginosa et S. aureus sur les surfaces solides a permis la visualisation de l’inhibition de la croissance ou des changements dans la production de phénotype, de pigment ou de polysaccharide de colonie14,15,16. Les biofilms d’espèces mixtes, sur des surfaces biotiques ou abiotiques, ainsi que la coculture d’espèces bactériennes en culture liquide ont également permis de mesurer les changements dans la croissance, le métabolisme, la tolérance aux antibiotiques, la concurrence et la viabilité, en plus de l’expression des gènes et des protéines17,18. Bien que ces expériences culturelles en vrac aient révélé comment P. aeruginosa et S. aureus pourraient s’influencer mutuellement à l’échelle communautaire, ils sont incapables de répondre à des questions importantes sur les interactions qui ont lieu au niveau unicellulaire. La méthode présentée ici ajoute aux approches pour l’étude des interactions inter-espèces en se concentrant sur les changements dans le mouvement, la viabilité cellulaire, et l’expression des gènes des cellules uniques au sein d’une communauté coculturée au fil du temps.
Les interactions unicellulaires peuvent différer considérablement des interactions qui ont lieu dans une communauté de cellules en vrac. Grâce à l’analyse unicellulaire, l’hétérogénéité au sein d’une communauté peut être quantifiée pour étudier comment le placement spatial des cellules influence la dynamique de la communauté ou comment les niveaux d’expression des gènes et des protéines changent au sein des membres individuels d’un groupe. Les cellules de suivi peuvent également fournir un aperçu de la façon dont les cellules uniques se déplacent et se comportent au fil du temps, à travers plusieurs générations. En suivant simultanément le mouvement cellulaire et les changements dans l’expression des gènes, des corrélations peuvent être faites entre les fluctuations des gènes et les phénotypes correspondants. Des protocoles antérieurs pour l’étude des espèces bactériennes individuelles au niveau unicellulaire ont été décrits. Ces études tirent parti des cellules d’imagerie vivante au fil du temps dans un seul plan, et ont été utiles pour observer des phénotypes comme la division cellulaire et la susceptibilité aux antibiotiques19,20. D’autres microscopies d’imagerie vivante ont été utilisées pour surveiller la croissance, la motilité, la colonisation de surface et la formation de biofilms d’espèces bactériennes simples21,22,23. Cependant, bien que ces études aient été perspicaces pour comprendre la physiologie des bactéries en monoculture, les expériences pour observer le comportement unicellulaire de plusieurs espèces bactériennes au fil du temps dans la coculture sont limitées.
Ici, les protocoles antérieurs utilisés pour l’imagerie par une seule espèce ont été adaptés pour étudier les interactions entre P. aeruginosa et S. aureus. Ces organismes peuvent être différenciés en contraste de phase en fonction de leurs morphologies cellulaires(P. aeruginosa sont bacillis et S. aureus sont cocci). Le développement de cette méthode a récemment permis la visualisation de comportements de motilité précédemment non décrits de P. aeruginosa en présence de S. aureus24. P. aeruginosa s’est avéré capable de détecter S. aureus à distance et de répondre avec des mouvements monocellulaires accrus et directionnels vers des grappes de cellules de S. aureus. P. aeruginosa mouvement vers S. aureus a été trouvé pour exiger le type IV pili (TFP), projections de cheveux dont l’extension coordonnée et la rétraction générer un mouvement appelé motilité twitching25.
Ces études démontrent l’utilité de cette méthode pour interroger les interactions antérieures entre les espèces. Cependant, l’imagerie à des densités cellulaires élevées à des moments d’interaction ultérieurs est difficile étant donné que les couches uniques de cellules ne peuvent plus être identifiées, ce qui pose principalement des problèmes lors de l’analyse post-imagerie. Compte tenu de cette limitation, la méthode est la mieux adaptée pour les interactions antérieures qui pourraient ensuite être suivies avec des tests macroscopiques traditionnels à des densités cellulaires plus élevées représentatives des interactions ultérieures. Les limites supplémentaires de cette méthode incluent la nature à faible débit, puisqu’un seul échantillon peut être photographié à la fois et le coût du microscope, de la caméra et de la chambre environnementale. En outre, la microscopie de fluorescence pose des risques pour les cellules bactériennes comme la phototoxicité et le photobleaching, limitant ainsi la fréquence à laquelle les images de fluorescence peuvent être acquises. Enfin, les coussinets d’agarose utilisés dans cette méthode sont très sensibles aux changements dans l’environnement, ce qui rend essentiel pour contrôler des conditions comme la température et l’humidité, étant donné que les plaquettes peuvent commencer à rétrécir ou se développer si les conditions ne sont pas correctes. Enfin, bien que cette méthode n’imite pas l’environnement hôte, elle fournit des indices sur la façon dont différentes espèces bactériennes réagissent sur les surfaces, qui peuvent être suivies dans des tests conçus pour imiter les conditions environnementales/hôtes.
Cette méthode diffère des études précédentes de suivi du mouvement unicellulaire, en ce que les cellules sont inoculées entre un couvercle et un tampon agarose, limitant les cellules à la surface. Cela permet le suivi cellulaire au fil du temps dans un seul plan; toutefois, limite les cycles d’engagement transitoire de surface observés lorsque les cellules sont submergées dans le liquide26. Un autre avantage des bactéries d’imagerie sous un tampon d’agarose est qu’il imite les essais d’inoculation sub-surface macroscopiques à base de plaques classiquement utilisés pour examiner P. aeruginosa twitching motilité25. Dans ce test, les cellules bactériennes sont inoculées entre le fond d’une boîte de Pétri et l’agar, en gardant les cellules dans un seul plan comme ils se déplacent à travers le fond du plat vers l’extérieur à partir du point d’inoculation, un peu comme ce protocole de microscopie.
Le protocole de microscopie time-lapse pour visualiser les interactions interspécifères présenté ici se compose de 1) la préparation de l’échantillon bactérien et du tampon d’agarose, 2) la sélection des paramètres de microscope pour l’acquisition d’imagerie et 3) l’analyse post-imagerie. La visualisation détaillée du mouvement et du suivi des cellules peut être effectuée par l’acquisition d’images à de courts intervalles de temps par contraste de phase. La microscopie de fluorescence peut également être utilisée pour déterminer la viabilité cellulaire ou l’expression des gènes au fil du temps. Ici, nous montrons un exemple d’adaptation pour la microscopie de fluorescence par l’ajout de colorants de viabilité aux coussinets d’agarose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes présentées ici décrivent un protocole pour l’imagerie à cellules vivantes des interactions des espèces bactériennes au niveau unicellulaire avec des modifications pour d’autres applications, y compris le suivi cellulaire et la viabilité des cellules. Cette méthode ouvre de nouvelles avenues pour étudier les comportements unicellulaires des micro-organismes en coculture avec d’autres espèces au fil du temps. Plus précisément, le protocole démontre l’utilité de cette méthode de cocultur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par le financement du Prix de transition postdoc-faculté de la Fondation de la fibrose kystique LIMOLI18F5 (DHL), du Prix de recrutement junior des professeurs de la Fondation de la fibrose kystique LIMOLI19R3 (DHL) et de la Bourse de formation T32 des NIH 5T32HL007638-34 (ASP). Nous remercions Jeffrey Meisner, Minsu Kim et Ethan Garner d’avoir partagé les protocoles initiaux et les conseils pour l’imagerie et la fabrication de plaquettes.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
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