Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi
Summary
Bu protokol, in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak için kurallı bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, iskelet fenotipini analiz etmek için transgenik bir fare modeli ve bazı kurallı teknikler kullanır.
Abstract
Transgenik fare modelleri, osteoklast farklılaşmasını ve aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak ve osteoporozun mekanizmalarını ve farmasötik tedavilerini incelemek için güçlüdür. Cathepsin K (Ctsk)-Cre fareleri osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Transkripsiyon 3’ün (STAT3) sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü kemik homeostazında geçerlidir, ancak in vivo osteoklastlardaki rolü zayıf tanımlanmıştır. STAT3’ün osteoklast farklılaşmasına ve kemik metabolizmasına katıldığına dair in vivo kanıtları sağlamak için osteoklast spesifik bir Stat3 silme fare modeli(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) ve iskelet fenotipini analiz etti. Mikro-CT tarama ve 3D rekonstrüksiyon, koşullu nakavt farelerinde kemik kütlesinin arttığını ima etti. Kemik metabolizmasını tespit etmek için H&E lekelenmesi, kalsesin ve alizarin kırmızı çift boyama ve tarta dayanıklı asit fosfataz (TRAP) lekeleme yapıldı. Kısacası, bu protokol iskelet fenotipini analiz etmek ve in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri incelemek için bazı kurallı yöntem ve teknikleri açıklar.
Introduction
İskelet kemiği insan vücudunun ana yük taşıyan organıdır ve yürüyüş ve egzersiz sırasında hem iç hem de dış ortamdan baskı altındadır1. Kişinin yaşamı boyunca, kemikler sürekli olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından dengelenen kendini yenilemeden geçer. Osteoklastların eski kemikleri temizleme ve osteoblastların yeni kemik oluşturma süreci, iskelet sisteminin homeostazını ve mekanik işlevini korur2. Dengedeki bozukluk osteoporoz gibi kemik metabolik hastalıklarına neden olabilir. Aşırı osteoklastik aktivitenin neden olduğu osteoporoz, küresel olarak yaygındır ve topluma önemli ekonomik kayıplara neden olur2,3,4. Osteoporoz tedavisi için mevcut sınırlı sayıda ilada ve yan etki risklerine göre4, osteoklast oluşumu ve aktivitesinin ayrıntılarını ortaya çıkarmak önemlidir.
Monosit/makrofaj hematopoetik soyundan elde edilen osteoklastlar birden fazla çekirdeğe sahiptir (2 ila 50 çekirdek olabilir) ve büyüktür (genellikle çapı 100 μm’den büyüktür)2. Mekanizmaların keşfi ve ilaçların osteoklastik bozukluklar için taranma in vitro osteoklast kültürü ile yaygın olarak geliştirilmiş olmasına rağmen, karmaşık organik reaksiyonlar in vivo kanıtları hedeflenen tedavi için vazgeçilmez kılmaktadır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve patofizyolojik benzerlikler nedeniyle, genetik olarak tasarlanmış fare modelleri, insan hastalığının mekanizmalarını ve farmasötik tedavilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır in vivo6. Cre-loxP sistemi fare gen düzenlemesi için yaygın olarak kullanılan bir teknolojidir ve araştırmacıların gen fonksiyonlarını doku/hücreye özgü bir şekilde araştırmalarını sağlamıştır5. Cathepsin K (CSTK), kemik kollajen8’ibozabilen osteoklastlar tarafından salgılanan sistein proteazdır. CTSK’nın olgun osteoklastlarda seçici olarak ifade edildiği iyi kabul edilmektedir; Bu nedenle, Ctsk-Cre fareleri osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yararlı bir araç olarak kabul edilir ve6.
Transkripsiyon (STAT) ailesinin sinyal dönüştürücüsü ve aktivatörü klasiktir ve bağışıklık ve kanser ilerlemesi ve gelişiminde oldukça önemlidir7,8. Yedi STAT arasında, STAT3’ün kemik homeostazı9,10ile en alakalı olduğu bildirilmektedir. Çeşitli in vivo çalışmalar, OSTEOBLASTLARDA STAT3’ün spesifik inaktivasyonunun kemik oluşumunu azalttığını bildirmektedir9,10. Bununla birlikte, STAT3’ün osteoklast oluşumuna ve kemik metabolizmasına in vivo katılımına ilişkin sağlam kanıtlar hala sınırlıdır. Son zamanlarda, osteoklast spesifik Stat3 silme fare modeli (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, bundan sonra Stat3Ctskolarak adlandırılır) STAT3 osteoklast farklılaşmasına ve kemik metabolizması11‘e katılır. Bu çalışmada, osteoklast spesifik STAT3 delesyonunun kemik homeostazı üzerindeki etkisini incelemek için Stat3Ctsk farelerinin kemik kütlesi, kemik histoporfolojisi ve kemik anabolizması ve katabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için kullandığımız yöntem ve protokolleri açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri genellikle insan hastalığının mekanizmasını ve farmasötik tedavisini incelemek için kullanılır13. Ctsk-Cre fareler osteoklastların fonksiyonel çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır6. Bu çalışmada iskelet fenotipini analiz etmek ve in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri incelemek için yöntemlerin protokolleri açıklanmıştır.
Histolojik a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prof. Weiguo Zou ve S. Kato’ya reaktifler ve fareler için ve Zou laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Kraniyofasiyal Anomaliler Için Dijitalleştirilmiş Stomatoloji ve Araştırma Merkezi Laboratuvarı’na yardım için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (NSFC) hibeleriyle desteklendi [81570950,81870740,81800949], Şanghay Zirvesi & Plato Disiplinleri, Şanghay Hassas Tıp Enstitüsü’nden SHIPM-mu fonu, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi [JC201809], Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi için Üst Düzey İnovasyon Ekibinin Teşvik Projesi , Shanghai JiaoTong üniversitesi Tıp Fakültesi Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Disiplinler Arası Araştırma Fonu [JYJC201902]. Ve L.J. Üstün Gençlik Tıbbi Yetenekleri, Şanghay “Tıbbi Yeteneğin Yükselen Yıldızları” Gençlik Geliştirme Programı ve Şanghay Jiaotong Üniversitesi’nden “Chen Xing” projesinin bir bilginidir.
Materials
| 4% Paraformaldehyde solution | Sangon biotech Co., Ltd. | E672002 | |
| Acetone | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 80000360 | |
| Alizarin | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Ammonia solution | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | ||
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Ctsk-Cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| DeCa RapidlyDecalcifier | Pro-Cure | DX1100 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| EDTA | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 60-00-4 | |
| EMBED 812 RESIN | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| fluorescence microscope | Olympus | IX73 | |
| Hematoxylin solution | Beyotime Biotechanology | C0107 | |
| Micro-CT | Scanco Medical AG | μCT 80 | |
| NaHCO3 | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 10018918 | |
| Neutral balsam | Sangon biotech Co., Ltd. | E675007 | |
| NMA | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| rotary microtome | Leica | RM2265 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| xylene | Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd. | 1330-20-7 |
References
- Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
- Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
- Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), 243-246 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
- Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
- Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
- Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
- Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
- Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
- Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
- Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
- Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
- Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
- Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
- Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
- Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
- Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
- Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
- Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14 (2018).
