Måling af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskulatur fra mus
Summary
Intakt regulering af muskelglukoseoptagelse er vigtig for at opretholde glukosehomeostase i hele kroppen. Denne protokol præsenterer vurdering af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskel, når man afgrænser virkningen af forskellige fysiologiske interventioner på hele kroppens glukosemetabolisme.
Abstract
Skeletmuskulatur er et insulinresponsivt væv og optager typisk det meste af den glukose, der kommer ind i blodet efter et måltid. Desuden er det blevet rapporteret, at skeletmuskulatur kan øge ekstraktionen af glukose fra blodet med op til 50 gange under træning sammenlignet med hvileforhold. Stigningen i muskelglukoseoptagelsen under træning og insulinstimulering afhænger af translokationen af glukosetransportør 4 (GLUT4) fra intracellulære rum til muskelcelleoverflademembranen samt fosforylering af glucose til glucose-6-phosphat ved hexokinase II. Isolering og inkubation af musemuskler som m. soleus og m. extensor digitorum longus (EDL) er en passende ex vivo-model til at studere virkningerne af insulin og elektrisk induceret sammentrækning (en model til træning) på glukoseoptagelse i moden skeletmuskel. Ex vivo-modellen tillader således evaluering af muskelinsulinfølsomhed og gør det muligt at matche muskelkraftproduktionen under sammentrækning, hvilket sikrer ensartet rekruttering af muskelfibre under målinger af muskelglukoseoptagelse. Desuden er den beskrevne model velegnet til farmakologisk forbindelsestestning, der kan have indflydelse på muskelinsulinfølsomheden eller kan være til hjælp, når man forsøger at afgrænse den regulatoriske kompleksitet af skeletmuskulaturglukoseoptagelse.
Her beskriver og giver vi en detaljeret protokol om, hvordan man måler insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isolerede og inkuberede soleus- og EDL-muskelpræparater fra mus ved hjælp af radioaktivt mærket [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. Dette muliggør nøjagtig vurdering af glukoseoptagelsen i moden skeletmuskulatur i fravær af forvirrende faktorer, der kan forstyrre den intakte dyremodel. Derudover giver vi oplysninger om metabolisk levedygtighed af inkuberet museskeletmuskulatur, hvilket tyder på, at den anvendte metode har nogle forbehold under visse betingelser, når man studerer muskelenergimetabolisme.
Introduction
Skeletmuskulatur besidder evnen til at udtrække store mængder glukose fra det ekstracellulære rum som reaktion på insulin og motion. Dette hjælper med at opretholde glukosehomeostase i hele kroppen og sikrer glukoseforsyningen i tider med høj energiefterspørgsel. Da intakt regulering af skeletmuskulaturens glukoseoptagelse har vist sig at være vigtig for den generelle sundhed og fysiske ydeevne 1,2, har målinger af muskelglukoseoptagelse under forskellige forhold fået stor opmærksomhed. Hos mennesker og dyr er den hyperinsulinæmiske-euglykæmiske klemme blevet anvendt som guldstandardteknik til vurdering af insulinfølsomhed in vivo 3,4. I modsætning til resultater opnået ved en oral glukosetolerancetest kræver den hyperinsulinemiske-euglykæmiske klemmeteknik ikke intakt gastrointestinal funktion eller insulinsekretion fra bugspytkirtlen og gør det således muligt at sammenligne insulinresponser mellem forsøgspersoner, der udviser variationer i mave-tarm- og/eller bugspytkirtelfunktionen. Målinger af muskelglukoseoptagelse in vivo under træning hos mennesker er blevet udført hyppigt siden 1960’erne5. Først ved anvendelse af arteriovenøse balanceteknikker6 og senere ved anvendelse af positronemissionstomografi (PET) billeddannelse i kombination med en positron, der udsender glucoseanalog, f.eks. 18F-Fluor-deoxy-glucose7. Hos gnavere udføres træningsstimuleret muskelglukoseoptagelse in vivo typisk ved anvendelse af radioaktive eller stabile isotopmærkede glucoseanaloger 8,9,10.
En supplerende metode til målinger af muskelglukoseoptagelse in vivo er at isolere og inkubere små muskler fra gnavere og efterfølgende måle glukoseoptagelsen ved hjælp af radioaktive eller stabile isotopmærkede glucoseanaloger 11,12,13. Denne metode muliggør nøjagtig og pålidelig kvantificering af glukoseoptagelseshastigheder i moden skeletmuskel og kan udføres i nærvær af forskellige insulinkoncentrationer og under sammentrækning fremkaldt af elektrisk stimulering. Endnu vigtigere er målinger af glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet skeletmuskulatur af relevans, når man undersøger muskelmetabolisk fænotype hos mus, der har gennemgået forskellige interventioner (f.eks. Ernæring, fysisk aktivitet, infektion, terapi). Den isolerede skeletmuskelmodel er også et egnet redskab til test af farmakologiske forbindelser, der kan påvirke glukoseoptagelsen i sig selv og/eller ændre insulinfølsomheden12,14. På denne måde kan effekten af forbindelser, der er designet til at regulere muskelglukosemetabolismen, testes og evalueres i et stærkt kontrolleret miljø inden efterfølgende in vivo-test i prækliniske dyremodeller.
Under visse omstændigheder kan metabolisk levedygtighed udgøre en udfordring i det isolerede og inkuberede skeletmuskelmodelsystem. Manglen på et kredsløbssystem i de inkuberede muskler indebærer faktisk, at levering af substrater (f.eks. Ilt og næringsstoffer) helt afhænger af simpel diffusion mellem muskelfibrene og det omgivende miljø. I den forbindelse er det vigtigt, at de inkuberede muskler er små og tynde og dermed udgør en mindre barriere for iltdiffusion under inkubation15. Især under langvarige inkubationer i flere timer kan hypoxiske tilstande udvikle sig på grund af utilstrækkelig iltforsyning, hvilket resulterer i muskelenergiudtømning15. Selvom forskellige markører for metabolisk levedygtighed i inkuberet rottemuskel tidligere er blevet rapporteret sammen med identifikationen af vigtige variabler, der hjælper med at opretholde rottemuskelens levedygtighed15, er en omfattende evaluering af metabolisk levedygtighed i små inkuberede musemuskler stadig berettiget. Derfor er glykogenindholdet i øjeblikket hovedsageligt blevet anvendt som en markør for metabolisk levedygtighed i inkuberet museskeletmuskel16,17.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af basal-, insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet soleus- og EDL-muskel fra mus ved hjælp af radioaktivt mærket [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. I den foreliggende undersøgelse blev glukoseoptagelsen målt over en periode på 10 minutter, og metoden præsenteres ved anvendelse af submaksimalt og maksimalt effektive insulinkoncentrationer samt en enkelt sammentrækningsprotokol. Imidlertid kan de protokoller, der er beskrevet heri, let ændres med hensyn til inkubationstid, insulindosering og elektrisk stimuleringsprotokol. Desuden giver vi en grundig karakterisering af forskellige markører for metabolisk levedygtighed i inkuberet soleus og EDL musemuskel. Resultaterne indikerer, at glukosetilskud til inkubationsbufferen er afgørende for at bevare metabolisk levedygtighed af muskler inkuberet i 1 time.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intakt regulering af glukoseoptagelsen i skeletmuskulaturen er vigtig for at bevare det generelle helbred1. Således tjener undersøgelse af muskelglukoseoptagelse ofte som en primær aflæsning, når man evaluerer forskellige sundhedsændrende interventioner. Her beskriver vi en ex vivo-metode til måling af glukoseoptagelse i isolerede og inkuberede soleus- og EDL-muskler fra mus som reaktion på insulin og elektrisk inducerede sammentrækninger. Metoden er hurtig og pålidelig og muliggør en p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af bevillinger fra Det Frie Forskningsråd – Medicinsk Videnskab (FSS8020-00288B) og Novo Nordisk Fonden (NNF160C0023046). Dette arbejde blev også støttet af en forskningsbevilling til Rasmus Kjøbsted fra Danish Diabetes Academy, som er finansieret af Novo Nordisk Fonden, bevillingsnummer NNF17SA0031406. Forfatterne vil gerne takke Karina Olsen, Betina Bolmgren og Irene Bech Nielsen (Institut for Idræt og Ernæring, Det Natur- og Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet) for deres dygtige tekniske bistand.
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
References
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), 230-235 (1983).
- Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
- Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
- Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
- Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
- Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
- Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5′-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
- Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
- Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
- Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
- Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
- van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
- Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
- Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
- Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
- Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
- Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
- Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
- Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
- Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), 184-191 (1998).
- Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
- Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
- Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
- Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
- Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
- Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
- Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
- Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), 154-160 (1991).
- Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
- Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
- Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
- Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).
