Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller
Summary
Strålingsindusert DNA-skaderespons aktivert av nøytron blandet stråle som brukes i bor nøytronfangstbehandling (BNCT) er ikke fullt etablert. Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å oppdage strålingsindusert foci (RIF) av reparasjonsproteiner ved immunofluorescensfarging i humane tykktarmskreftcellelinjer etter bestråling med nøytronblandet stråle.
Abstract
Formålet med manuskriptet er å gi en trinnvis protokoll for å utføre immunofluorescensmikroskopi for å studere strålingsindusert DNA-skaderespons indusert av nøytron-gamma blandet stråle som brukes i borron nøytronfangstterapi (BNCT). Spesielt brukes den foreslåtte metodikken for påvisning av reparasjonsproteiner aktivering som kan visualiseres som foci ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for DNA dobbelttrådpauser (DNA-DSB). DNA reparasjon foci ble vurdert av immunofluorescens i tykktarmskreftceller (HCT-116) etter bestråling med nøytron-blandet stråle. DNA-DSB er de mest gentoksiske lesjonene og repareres i pattedyrceller ved to hovedveier: ikke-homologende end-joining pathway (NHEJ) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR). Frekvensene av foci, immunkjemisk farget, for vanlig brukte markører i radiobiologi som γ-H2AX, 53BP1 er forbundet med DNA-DSB-nummer og anses som effektive og følsomme markører for overvåking av induksjon og reparasjon av DNA-DSB. Det ble fastslått at γ-H2AX foci tiltrekke reparasjon proteiner, noe som fører til en høyere konsentrasjon av reparasjonsfaktorer i nærheten av en DSB. For å overvåke DNA-skader på cellenivå, ble immunofluorescensanalyse for tilstedeværelse av DNA-PKcs representant reparasjon protein foci fra NHEJ banen og Rad52 fra HRR banen planlagt. Vi har utviklet og introdusert en pålitelig immunofluorescensfargingsprotokoll for påvisning av strålingsindusert DNA-skaderespons med antistoffer som er spesifikke for reparasjonsfaktorer fra NHEJ- og HRR-veier og observert strålingsindusert foci (RIF). Den foreslåtte metodikken kan brukes til å undersøke reparasjonsprotein som er sterkt aktivert i tilfelle nøytron-blandet strålestråling, og indikerer dermed dominansen av reparasjonsveien.
Introduction
Strålingsindusert DNA-skaderespons aktivert av nøytron blandet stråle som brukes i bor nøytronfangstbehandling (BNCT) er ikke fullstendig bestemt. Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å utføre påvisning av strålingsindusert foci (RIF) av reparasjonsproteiner ved immunofluorescensfarging, f.eks.
Ioniserende stråling (IR) induserer en rekke forskjellige typer DNA-skader (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA base skade) hvorav DNA dobbel-strand pauser er de mest gentoksiske DNA lesjoner1. Ureparerte pauser kan forårsake celledød, mens feilparerte pauser øker sannsynligheten for kromosom omorganisering, mutagenese og tap av avgjørende genetisk informasjon. Skaderesponsbanene som reagerer på DSBs inkluderer veier av DNA-reparasjon som ikke-homolog sluttkobling (NHEJ), en mekanisme som krever Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 og DNA ligase IV som viktige faktorer2,,3,4,5,6. Hos pattedyr er den andre viktigste DNA-reparasjonsveien homolog rekombinasjonsreparasjon (HRR) som krever viktige komponenter – Genfamilien Rad52 epistase– Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 og Rad587. Rad51 og Rad54 er viktige menneskelige rekombinasjonsfaktorer involvert i reparasjonsmekanismer knyttet til replikeringsstress og DNA-brudd i eukaryoter. Interessant, ble det observert at nedregulering av HRR banen forbedrer NHEJ banen som er feilutsatt peker på HR pathway relevans for genom stabilitet8.
Det første trinnet i DSBs dannelse er fosforylering av γ-H2AX histone på Ser-139 av Ataxia telangiectasia mutert kinase (ATM) fra PI3 kinase familie7,8. Interessant, H2AX fosforylering kan visualiseres lett ved immunofluorescens teknikk som foci (γ-H2AX foci) ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for fosforylerte H2AX6. Det er en 1:1 forhold mellom antall DSBs og γ-H2AX foci, derfor DSB markør, γ-H2AX, studeres mye gjennom karakterisering av foci dannelse, størrelse, og kvantitet6,,7,8,9,10,11. Dannelse av γ-H2AX foci fører til rekruttering og akkumulering av DNA skade respons (DDR) proteiner og kromatin-modifiserende faktorer, slik som 53BP1 (p53 bindende protein 1), MDC1 (mediator av DNA skade sjekkpunkt), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, og mange andre reparere faktorer dermed danner stråling-indusert foci (RIF). Alle disse proteinene samtidig lokaliseres med γ-H2AX gjennom direkte eller indirekte binding1,,11,,12.
Det er viktig å oppdage DNA-skade og reparasjon med en skikkelig sensitiv test, derfor er det mer oppmerksomhet til utviklingen av svært presiseteknikker 13. I forbindelse med DNA-skader og reparasjonsstudier er metodikken avgjørende for sensitiv påvisning av genom-DNA-skade, beskrivelse av skadekategori og kvantifisering av DNA-skade- og reparasjonsmekanismer13. For å oppdage enkeltceller med skadet DNA, brukes kometanalysen ofte i radiobiologiske studier14. Andre tilgjengelige cytogenetiske metoder gjenkjenner kromosomavarasjoner, inkludert disentriske, translokasjoner, asentriske fragmenter, ringer og kromatatiske typeavlastninger og mikronukleuskromosomskade (Mn). Den mest brukte metoden i radiobiologi, spesielt i biologisk dosimetry, er den disentriske kromosomanalysen på grunn av sin høye spesifisitet for stråling15. For eksempel kan PCR, en klassisk molekylær metode, ikke gjenkjenne typen oppdaget DNA-skade. I dette tilfellet passerer de immunometriske metodene følsomhetsnivået fordi reaksjonene er spesifikke mellom antigenet og antistoffet. Immunofluorescensavbildning gir visuelle bevis for utseendet av forskjellige proteiner i distinkte foci som svar på DNA-skadelige midler som ioniserende stråling16. Aktiveringsnivåene for skade og reparasjon av proteiner mRNA-nivåer kan imidlertid lett oppdages av PCR i sanntid, som er en riktig kvantitativ metode for videre molekylære studier i forbindelse med DNA-skaderespons17.
Tatt i betraktning at γ-H2AX foci tiltrekke reparasjonsfaktorer18, for å overvåke DNA skade og reparasjon på cellenivå, har vi utviklet en pålitelig immunofluorescens farging prosedyre, basert på analyse av den representative reparasjon protein foci fra NHEJ banen (DNA-PKcs) og Rad52 fra HRR-banen.
Her foreslår vi bruk av immunodetisering for disse proteinene som effektiv og sensitiv prosedyre for overvåking av DNA-DSB induksjon og reparasjon. Frem til nå har det ikke vært tilgjengelige data om DNA-DSB basert på foci av reparasjonsproteiner på cellenivå etter nøytron blandet strålebestråling for BNCT, unntatt γ-H2AX og 53BP1 markører19. Vi foreslår tilpasning av HCT-116 tykktarmskreft cellelinje, som det er rikt seg på DSBs foci, som en standard cellelinje for DNA skade analyse, fordi RIFs er lett påviselig. Denne tilhengercellelinjen er enkel å vedlikeholde og riktig for bestrålingsprosedyrer. Den foreslåtte prosedyren er basert på en stor mengde tidligere studier knyttet til den generelle immunfluorescensprosedyren for γ-H2AX-farging. Det inneholder imidlertid alle detaljer om valg av passende antistoffer med testede fortynninger for hvert representativt protein som tilhører hver reparasjonsvei. Videre beskriver den utnyttelsen av en unik nøytron-blandet stråle som brukes i BNCT-terapi. Vi anbefaler imidlertid å utvide studiene med begge metodene, immunfluorescensfarging først og da, med høykost molekylær analyse som utført tidligere4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frekvensene av foci, immunkjemisk farget for γ-H2AX og 53BP1 brukes ofte i radiobiologi og er forbundet med DNA-DSB-nummer og anses som effektive og følsomme markører for overvåking av induksjon og reparasjon av DNA-DSBs19. Co-farging prosedyren av γ-H2AX og 53BP1 er en standard prosedyre for påvisning av DNA-DSBs. Dannelse av γ-H2AX foci er forbundet med rekruttering av 53BP1, en regulator av DNA skade respons23. Ulike cellelinjer kan imidlertid variere i bakgrunnsn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nøytron-blandet stråle bestående av nøytron/gammastråling ble åpnet fra Maria-forskningsreaktoren i National Centre for Nuclear Research i Polen. K.M.O. ble støttet av National Science Centre, Polen (Miniatura 2) stipend #2018 nr.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Recherche en cancérologie. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
