Поколение и количественная характеристика функциональных и поляризованных желчных эпителиальных кист
Summary
Трехмерные (3D) клеточные системы являются актуальными моделями для изучения органогенеза. Предлагается метод на основе гидрогеля для производства желчных кист и их характеристики. Этот протокол распутывает барьеры 3D-характеристики, с помощью простого и надежного метода оценки эффективности образования кисты, размеров и проверки их функциональности.
Abstract
Холангиоциты, эпителиальные клетки, которые выстраиваются желчных протоков в печени, контролировать образование желчи и модификации. В последние двадцать лет, в контексте заболеваний печени, 3-мерные (3D) модели на основе холангиоцитов появились такие как кисты, сфероиды, или трубчатые структуры для имитации топологии тканей для органогенеза, моделирования заболеваний, и исследования скрининга наркотиков. Эти структуры были в основном получены путем встраивания холангиоцитов в гидрогель. Основная цель состояла в изучении самоорганизации путем устранения эпителиальной полярности, функциональных и морфологических свойств. Тем не менее, очень немногие исследования сосредоточены на эффективности формирования кисты. В этом случае эффективность часто измеряется на основе изображений одной плоскости. Функциональные анализы и структурный анализ проводятся без представления потенциальной неоднородности распределения кисты, возникающей в результате гидрогелевой полимеризации неоднородности и побочных эффектов. Поэтому количественный анализ, когда он проводится, не может использоваться для сравнения с одной статьей на другую. Кроме того, эта методология не позволяет сравнивать 3D потенциал роста различных матриц и типов клеток. Кроме того, нет никакого упоминания об экспериментальном устранении неполадок для иммуностимуляторных кист. В этой статье мы предоставляем надежный и универсальный метод, чтобы показать, что первоначальное распределение клеток связано с неоднородным вертикальным распределением образования кисты. Клетки холангиоцитов, встроенные в гидрогель, следуют с анализом стеков вдоль глубины гидрогеля в течение 10 дней. С помощью этого метода, надежная кинета эффективность образования кисты и роста получается. Мы также представляем методы оценки полярности кисты и секретоорийной функции. Наконец, дополнительные советы по оптимизации иммуностимуляторов предоставляются для того, чтобы ограничить кист коллапс для визуализации. Этот подход может быть применен к другим исследованиям культуры 3D клеток, открывая тем самым возможности для сравнения одной системы с другой.
Introduction
За последние три десятилетия область исследований in vitro продвинулась к системам 3D-культуры. Ряд протоколов появились для культивирования клеток в 3D как сфероиды или агрегаты в присутствии или отсутствии эшафота / матрицы, в капле, в агитации, в микрофлюидных устройств, илиплавающей 1. Использование методов 3D культуры доказало свои преимущества перед 2-мерными (2D) культурами, особенно для эпителиальных клеток, которые были показаны для самоостроения в 3D структурах, называемых кистами или acini. В этом случае клетки образуют монослой, окружающий люмен, где клетки приобретают свой полный эпителиальный фенотип с улучшенными физиологическими специфическимифункциями 2.
Многочисленные исследования способствовали разработке методов формирования этих эпителиальных органоидов в естественных матрицах. Это позволило резюмировать взаимодействия виво-клеток и клеточной микроэнвиронности, получить установление и стабильность эпителиального фенотипа3,4,5,6,7. В последнее время, и в частности, с целью разработки трансплантируемых органоидов и расшифровки потребности микроокноронии для организации эпителиальной программы, синтетические гидрогели были разработаны для повышения образования эпителиальных acini8,9,10. К сожалению, эти исследования сообщают о качественных данных, или представить методы расчета с использованием внутренних ссылок, таких как соотношение кист над не-кисты в 2Dплоскости 8,9,10. Это исключает любое сравнение между различными исследованиями с точки зрения эффективности, стабильности или морфологической и физиологической характеристики эпителиальных органоидов.
Микронапсуляция эпителиальных клеток в бисере с использованием микрофлюидных устройств позволила более реалистичные количественные и сравнительные результаты. Используя эту технологию, органоиды из различных типов клеток были сформированы и дифференцированы на основе морфологии между различными 3Dклеточными структурами 11,12. Тем не менее, эта технология не проста в работе и требует использования чистых помещений для производства микрофлюидных устройств. Эта технология была создана для нескольких типов гидрогеля, но требует технической адаптации, которая будет применяться к другим гидрогелям, ограничивая ее универсальность. Таким образом, большинство исследований, направленных на разработку эпителиальных органоидов полагаться на встраивание эпителиальных клеток в гидрогель навалом. В этих методах часто пренебрегают высокой неоднородностью структурирования геля и распределения клеток внутри всей 3D-культуры. Таким образом, большинство анализов относятся к одним 2D-изображениям, которые представляют собой лишь очень грубое распределение различных клеточных объектов во всем 3D томе.
Заболевания, которые влияют на желчные протоки, такие как холангиокарцинома, желчные атрезии, первичный склерозирующий холангит, среди прочего, являются основной причиной смертности и заболеваемости. За исключением трансплантации печени, Нет эффективных методов лечения этих условий13. Усилия по расследованию образования желчных протоков, причин заболеваний и прогрессирования позволят разработать новые методылечения 14.
Билиарные органотипические модели кист, сфероидов или трубчатых структур с использованием нормальных или полученных пациентом, дифференцированных или прародителя полученных холангиоцитовклеточных линий были разработаны 15,16,17,18,19,20. Различные исследования повторили полярность холангиоцитов, экспрессию маркеров холангиоцитов, наличие ресничок, секретореторию холангиоцитов и реабсорбтивную способность, а также образование и обструкцию люмена; все из которых представляют собой важные характеристики фенотипа холангиоцитов,морфологии, и функции 15,17,19. Другие сообщили о поддержании пациентов полученных желчных органоидов в течение длительных периодоввремени 20. Недавно мы исследовали роль биохимических и биофизических сигналов на желчных кист органогенеза21. Важно отметить, что патогенез желчных атрезия была изучена в желчных сфероидов и труб7,22. Кроме того, были успешно изучены ключевые особенности первичного склерозирующий холангит, такие как холангиоциты, секреция провоспалительных цитокинов, а также набор макрофагов с использованием желчныхсфероидов 15,20. Тем не менее, воспроизводимые в пробирке 3D количественные модели, которые физиологически модулировать фенотип холангиоцитов, физиологии и микроокниронии, где эти вопросы могут быть решены по-прежнему необходимы. Кроме того, лишь немногие публикации сообщили эффективность формированиякисты 21,23. Это важный момент, чтобы установить, особенно при исследовании органогенеза, причины заболеваний, и корреляция реакции препарата с функцией холангиоцитов и поляризации. Кроме того, с различиями в эшафот / матрица используется от протокола к протоколу, трудно сравнить между системами. Для решения этих вопросов мы предлагаем количественный, надежный и универсальный метод генерации желчных кист, имитирующих образование люменов, поляризацию холангиоцитов и секреторный функцию холангиоцитов. Важно отметить, что мы представляем систематический анализ, проведенный по оси З по 3D-гелю при оценке с течением времени, эффективности образования кисты, размера, жизнеспособности, поляризации и функциональности. Кроме того, мы использовали естественный гидрогель и нормальные крысиные холангиоциты (NRC) в качестве примера для протокола, но другие природные или синтетические гидрогели, а также эпителиальные клетки могут быть использованы для формирования 3D кистозных структур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для изучения органогенеза и поддержания 3D клеточных структур, различные ткани были смоделированы, используя различные клеточные происхождение, но и различные типы внеклеточных матриц, включая синтетические гидрогели8,9,10,<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Николаса ЛаРуссо (Клиника Майо, Рочестер, Миннесота, Соединенные Штаты), который любезно предоставил линию сотовой линии СРН.
Эта работа получила финансовую поддержку как программы iLite RHU (грант ANR-16-RHUS-0005), так и ДГУ Гепатинова.
Мы благодарим Изабель Гарсин и Резо д’Образера Челлилера Пэрис Саклай за их поддержку в визуализации.
Materials
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA – flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , (2010).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
- Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
- Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
- Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
- Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
- Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
- Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D’hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
- Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies – Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
- Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
- De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
- Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
- Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
- Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
- Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
- Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
- Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. , (2019).
- Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
- Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
- Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O’Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
- Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).
