Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu
Summary
Üç boyutlu (3D) hücresel sistemler organogenezin araştırılması için uygun modellerdir. Safra kist üretimi ve karakterizasyonu için hidrojel bazlı bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, kist oluşumu verimliliğini, boyutlarını değerlendirmek ve işlevselliklerini test etmek için basit ve güvenilir bir yöntemle 3B karakterizasyonunun engellerini ortadan kaldırmaktadır.
Abstract
Kolanjiyositler, karaciğerdeki safra kanallarını oluşturan epitel hücreleri, safra oluşumunu ve modifikasyonu denetler. Son yirmi yılda, karaciğer hastalıkları bağlamında, kolanjiyositlere dayalı 3 boyutlu (3D) modeller, organogenez, hastalık modellemesi ve ilaç tarama çalışmaları için doku topolojisini taklit etmek için kistler, küreseloidler veya tüp benzeri yapılar gibi ortaya çıkmıştır. Bu yapılar esas olarak bir hidrojel kolanjiyositkitler katıştırma ile elde edilmiştir. Temel amaç epitelyal polarite, fonksiyonel ve morfolojik özellikleri ele alarak kendi kendini örgütleme çalışması oldu. Ancak, çok az çalışma kist oluşumu verimliliği üzerinde duruluyor. Bu durumda, verimlilik genellikle tek bir düzlemin görüntülerinden ölçülür. Hidrojel polimerizasyon heterojenitelerinden ve yan etkilerinden kaynaklanan kist dağılımının potansiyel heterojenliğini temsil etmeden fonksiyonel tahliller ve yapısal analizler yapılmaktadır. Bu nedenle, nicel çözümleme yapıldığında, bir makaleden diğerine karşılaştırma için kullanılamaz. Ayrıca, bu metodoloji farklı matrisler ve hücre türlerinin 3D büyüme potansiyelinin karşılaştırmalarına izin vermez. Ayrıca, immünboyama kistler için deneysel sorun giderme söz yoktur. Bu makalede, ilk hücre dağılımının kist oluşumunun heterojen dikey dağılımı ile ilişkili olduğunu göstermek için güvenilir ve evrensel bir yöntem sayılmiyoruz. Hidrojel gömülü kolanjiyosit hücreleri 10 gün boyunca hidrojel derinliği boyunca Z-yığınları analizi ile takip edilir. Bu yöntemle kist oluşumunda verimlilik ve büyüme sağlam bir kinetik elde edilir. Ayrıca kist polaritesini ve salgı fonksiyonunu değerlendirmek için yöntemler saklıyız. Son olarak, görüntüleme için kist çöküşünü sınırlamak için immünboyama protokollerini optimize etmek için ek ipuçları sağlanmıştır. Bu yaklaşım diğer 3D hücre kültürü çalışmalarına uygulanabilir, böylece bir sistemi diğer sistemle karşılaştırma olanakları açılabilir.
Introduction
Son otuz yılda, in vitro araştırma alanı 3D kültür sistemlerine doğru ilerlemiştir. Bir iskele/matrisin varlığında veya yokluğunda, bir damla, ajitasyonda, mikroakışkan cihazlarda veya yüzen 1’de, 3Boyutlu olarak hücreleri küresel olarak veyaagrega olarak bir dizi şekilde kültüre alma için bir dizi protokol ortaya çıkmıştır. 3D kültür yöntemlerinin kullanımı, özellikle kistler veya acini adı verilen 3Boyutlu yapılarda kendi kendini organize ettiği gösterilen epitel hücreleri başta olmak üzere 2 boyutlu (2D) kültürlere göre avantajlarını kanıtlamıştır. Bu durumda, hücreler bir lümen çevreleyen bir monolayer oluşturur, hücrelerin geliştirilmiş fizyolojik özel fonksiyonları ile tam epitel fenotip eldenerede 2.
Doğal matrislerde bu epitel organoidlerin oluşturulması için yöntemlerin geliştirilmesine çok sayıda çalışma katkıda bulunmuştur. Bu vivo hücre-hücre ve hücre-mikroçevre etkileşimleri recapitulate izin verdi, kurulması ve epitel fenotip istikrar elde etmekiçin 3,4,5,6,7. Son zamanlarda, ve özellikle nakledilebilir organoidler geliştirmek ve epitel programı düzenlemek için mikroortamın gereksinimini deşifre amacı ile, sentetik hidrojeller epitel acini oluşumunu artırmak için geliştirilmiştir8,9,10. Ne yazık ki, bu çalışmalar nitel veri raporu, ya da 2D düzlemde olmayan kistler üzerinde kistlerin oranı gibi iç referanslar kullanarak mevcut hesaplama yöntemleri8,9,10. Bu, epitel organoidlerinin verimlilik, stabilite veya morfolojik ve fizyolojik karakterizasyonu açısından farklı çalışmalar arasında herhangi bir karşılaştırma yıkmaktadır.
Mikroakışkan cihazlar kullanarak boncuklarda epitel hücrelerinin mikrokapsülasyonu daha gerçekçi nicel ve karşılaştırmalı sonuçlar almıştır. Bu teknoloji kullanılarak, çeşitli hücre tiplerinden organoidler oluşmuş ve farklı 3D hücresel yapılar arasında morfolojiye dayalı farklılaşmış11,12. Ancak, bu teknoloji ile çalışmak kolay değildir ve mikroakışkan cihazlar üretmek için temiz oda kullanımını gerektirir. Bu teknoloji hidrojeller birkaç tür için kurulmuştur ama teknik adaptasyon diğer hidrojeller için uygulanacak gerektirir, onun çok yönlülük kısıtlayan. Bu nedenle, epitel organoidler geliştirmek için amaçlanan çoğu çalışma bir hidrojel toplu epitel hücrelerinin katıştırma güveniyor. Bu yöntemlerde, tüm 3D kültür içinde jel strüktürasyonu ve hücre dağılımı yüksek heterojenlik genellikle ihmal edilir. Bu nedenle, analizlerin çoğu tek 2B görüntülerle ilgilidir, bu da yalnızca kabaca tüm 3B hacimdeki çeşitli hücresel nesnelerin dağılımını temsil eder.
Kolanjiokarsinom, safra atrezisi, primer sklerozan kolanjit gibi safra kanallarını etkileyen hastalıklar mortalite ve morbiditenin başlıca nedenidir. Karaciğer nakli dışında bu durumlar için etkili bir tedavi yoktur13. Safra yolu oluşumunu, hastalık nedenlerini ve ilerlemesini araştırma çabaları yeni tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır14.
Normal veya hasta kaynaklı, diferansiye veya ata türevi kolanjiyosit hücre hatları kullanan kist, küresel oidler veya tüp benzeri yapıların biliyer organotipik modelleri geliştirilmiştir15,16,17,18,19,20. Çeşitli çalışmalar da kolanjiyofit polaritere, kolanjisit belirteçlerinin ekspresyonu, silya varlığı, kolanjiyosit salgıve reabsorptif yetenek, ve lümen oluşumu ve obstrüksiyonu; bunların hepsi kolanjiyosit fenotip, morfoloji ve fonksiyon15,17,19önemli özelliklerini temsil eder. Diğerleri uzun süre hasta kaynaklı safra organoidleri bakım bildirdin20. Son zamanlarda, biz biliyer kistler organogenez biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları rolünüaraştırdı21. Daha da önemlisi, biliyer atrezisi patogenezi safra spheroidleri ve tüpler7,22çalışıldı. Ayrıca, kolanjiyosit senescence, pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanması gibi birincil sklerozan kolanjitin temel özellikleri, yanı sıra makrofaj işe başarıyla safra spheroids kullanılarak çalışılmıştır15,20. Ancak, bu soruların ele alınabileceği kolanjiyosit fenotip, fizyoloji ve mikroçevreyi fizyolojik olarak modüle eden in vitro 3D kantitatif modellere hala ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca, sadece birkaç yayın kist oluşumu verimliliği21,23 bildirdin. Bu, özellikle organogenez, hastalık nedeni ve kolanjiyosit fonksiyonu ve polarizasyon ile ilaç yanıtlarının korelasyonunu araştırırken, saptanması gereken önemli bir noktadır. Buna ek olarak, protokolden protokole kadar kullanılan iskele/matris farklılıkları ile sistemler arasında karşılaştırmak zordur. Bu sorunları çözmek için lümen oluşumunu, kolanjisit polarizasyonunu ve kolanjiyit salgı işlevini taklit eden biliyer kistler oluşturmak için nicel, güvenilir ve evrensel bir yöntem öneriyoruz. Daha da önemlisi, zaman içinde değerlendirilirken 3D jel boyunca Z-ekseni boyunca yapılan sistematik bir analiz, kist oluşumu verimliliği, boyut, canlılık, polarizasyon ve işlevsellik sayılmaktadır. Ayrıca, doğal bir hidrojel ve normal sıçan kolanjiyositler (NRC) s, protokol için bir örnek olarak kullanılan, ancak diğer doğal veya sentetik hidrojeller, yanı sıra epitel hücreleri 3D kistik yapıların oluşumu için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organogenez ve 3D hücresel yapıların bakım çalışması için, çeşitli dokular modellenmiştir, farklı hücresel kökenleri kullanarak ama aynı zamanda sentetik hidrojeller de dahil olmak üzere ekstra-hücresel matrisfarklı türleri8,9,10,21. Ancak, organoidoluşumu veya işlevselliği açısından yöntemler arasında karşılaştırmalar sağlar 3D kantitatif analiz eksikliği nede…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Amerika Birleşik Devletleri), kim nazilikle NRC hücre hattı sağlanan teşekkür ederiz.
Bu çalışma hem iLite RHU programı (grant ANR-16-RHUS-0005) hem de DHU Hepatinov’un mali desteğini almıştır.
Isabelle Garcin ve Réseau d’Imagerie Cellulaire Paris Saclay’e görüntüleme konusundaki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA – flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , (2010).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
- Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
- Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
- Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
- Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
- Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
- Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D’hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
- Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies – Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
- Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
- De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
- Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
- Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
- Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
- Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
- Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
- Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. , (2019).
- Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
- Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
- Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O’Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
- Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).
