Geração e Caracterização Quantitativa de Cistos Epiteliais Biliar funcionais e polarizados
Summary
Sistemas celulares tridimensionais (3D) são modelos relevantes para investigar organogênese. Propõe-se um método à base de hidrogel para a produção de cistos biliares e sua caracterização. Este protocolo desvenda as barreiras da caracterização 3D, com um método simples e confiável para avaliar a eficiência, tamanhos e testar sua funcionalidade.
Abstract
Cholangiocytes, as células epiteliais que alinham os dutos biliares no fígado, supervisionam a formação e modificação da bile. Nos últimos vinte anos, no contexto das doenças hepáticas, surgiram modelos tridimensionais (3D) baseados em cholangiocitos, como cistos, esferoides ou estruturas semelhantes a tubos para imitar topologia tecidual para organogênese, modelagem de doenças e estudos de rastreamento de medicamentos. Essas estruturas foram obtidas principalmente pela incorporação de cholangiocitos em um hidrogel. O objetivo principal foi estudar a auto-organização abordando a polaridade epitelial, propriedades funcionais e morfológicas. No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na eficiência da formação de cistos. Quando este é o caso, a eficiência é muitas vezes quantificada a partir de imagens de um único plano. Ensaios funcionais e análises estruturais são realizados sem representar a potencial heterogeneidade da distribuição de cisto surgida de heterogeneidades de polimerização de hidrogel e efeitos colaterais. Portanto, a análise quantitativa, quando feita, não pode ser utilizada para comparação de um artigo com outro. Além disso, essa metodologia não permite comparações do potencial de crescimento 3D de diferentes matrizes e tipos de células. Além disso, não há menção à solução experimental de problemas para cistos imunossínetos. Neste artigo, fornecemos um método confiável e universal para mostrar que a distribuição celular inicial está relacionada à distribuição vertical heterogênea da formação de cisto. As células de colangiocitos embutidas em hidrogel são seguidas com a análise de pilhas de Z ao longo da profundidade do hidrogel ao longo do tempo de 10 dias. Com este método, obtém-se uma cinética robusta da eficiência e crescimento da formação de cistos. Também apresentamos métodos para avaliar a polaridade do cisto e a função secreta. Finalmente, dicas adicionais para otimizar protocolos de imunossuagem são fornecidas a fim de limitar o colapso do cisto para imagens. Essa abordagem pode ser aplicada a outros estudos de cultura celular 3D, abrindo assim as possibilidades de comparar um sistema com outro.
Introduction
Nas últimas três décadas, o campo da pesquisa in vitro avançou em direção aos sistemas de cultura 3D. Uma série de protocolos surgiram para a cultura de células em 3D como esferoides ou agregados na presença ou ausência de um andaime/matriz, em uma gota, em agitação, em dispositivos microfluidos, ou flutuante1. O uso de métodos de cultura 3D provou suas vantagens sobre culturas bidimensionais (2D), particularmente para células epiteliais, que foram demonstradas para auto-organizar em estruturas 3D, chamadas cistos ou acini. Neste caso, as células formam uma monocamada circundando um lúmen, onde as células adquirem seu fenótipo epitelial completo com funções específicas fisiológicas melhoradas2.
Inúmeros estudos têm contribuído para o desenvolvimento de métodos para a formação desses organoides epiteliais em matrizes naturais. Isso permitiu recapitular interações in vivo célula-célula e microambiente celular, para obter o estabelecimento e a estabilidade do fenótipo epitelial3,4,5,6,7. Recentemente, e em particular com o objetivo de desenvolver organoides transplantáveis e decifrar a exigência do microambiente para orquestrar o programa epitelial, hidrogéis sintéticos foram desenvolvidos para melhorar a formação de acini epitelial8,9,10. Infelizmente, esses estudos relatam dados qualitativos, ou apresentam métodos de cálculo utilizando referências internas, como a razão de cistos sobre não cistos em um plano 2D8,9,10. Isso exclui qualquer comparação entre diferentes estudos em termos de eficiência, estabilidade ou caracterização morfológica e fisiológica dos organoides epiteliais.
A microencapsulação de células epiteliais em contas usando dispositivos microfluidos permitiu resultados quantitativos e comparativos mais realistas. Utilizando essa tecnologia, organoides de vários tipos celulares foram formados e diferenciados com base na morfologia entre diferentes estruturas celulares 3D11,12. No entanto, essa tecnologia não é fácil de trabalhar e requer o uso de salas limpas para produzir os dispositivos microfluidos. Esta tecnologia foi estabelecida para alguns tipos de hidrogéis, mas requer adaptação técnica para ser aplicada a outros hidrogéis, restringindo sua versatilidade. Portanto, a maioria dos estudos destinados a desenvolver organoides epiteliais dependem da incorporação de células epiteliais em um granel de hidrogel. Nesses métodos, a alta heterogeneidade da estruturação em gel e distribuição celular dentro de toda a cultura 3D é muitas vezes negligenciada. Portanto, a maioria das análises diz respeito a imagens 2D únicas, que representam apenas muito aproximadamente a distribuição dos vários objetos celulares em todo o volume 3D.
Doenças que afetam os ductos biliares, como o colangiocarcinoma, atresia biliar, cholangite esclerosante primária, entre outras, são uma das principais causas de mortalidade e morbidade. Com exceção do transplante de fígado, não há tratamentos eficazes para essas condições13. Os esforços para investigar a formação de dutos biliares, as causas da doença e a progressão permitirão o desenvolvimento de novas terapias14.
Foram desenvolvidos modelos organotipicos biliares de cistos, esferoides ou estruturas semelhantes a tubos utilizando linhas celulares de cholangiocitos normais ou derivadas do paciente, diferenciadas ou progenitoras,15,16,17,18,19,20. Vários estudos têm polarização de colangiocito recapitulado, expressão de marcadores de cholangiocito, presença de cílios, collangiocitos secretos e capacidade reabsortiva, e formação e obstrução de lúmen; todas elas representam características importantes do fenótipo de colangiocito, morfologia e função15,17,19. Outros relataram a manutenção de organoides biliar derivados do paciente por longos períodos detempo 20. Recentemente, investigamos o papel das pistas bioquímicas e biofísicas sobre cistos biliares organogênese21. Importante ressaltar que a patogênese da atresia biliar foi estudada em esferoides biliares e tubos7,22. Além disso, características-chave da colangite esclerosante primária, como senescência de colangiocito, secreção de citocinas pró-inflamatórias, bem como o recrutamento de macrófagos foram estudados com sucesso usando esferoides biliares15,20. No entanto, modelos quantitativos in vitro in vitro 3D que modulam fisiologicamente fenótipo de collangiocito, fisiologia e microambiente onde essas questões podem ser abordadas ainda são necessários. Além disso, apenas poucas publicações relataram eficiência de formação de cisto21,23. Este é um ponto importante a se estabelecer, particularmente ao investigar organogênese, causa da doença e correlação de respostas medicamentosas com função de cholangiocito e polarização. Além disso, com diferenças no andaime/matriz utilizadas do protocolo ao protocolo, é difícil comparar entre sistemas. Para resolver essas questões, propomos um método quantitativo, confiável e universal para gerar cistos biliares imitando a formação de lúmen, a polarização do cholangiocyte e a função secreta do cholangiocito. É importante ressaltar que apresentamos uma análise sistemática realizada ao longo do eixo Z ao longo do gel 3D ao avaliar ao longo do tempo, eficiência de formação de cisto, tamanho, viabilidade, polarização e funcionalidade. Além disso, utilizamos um hidrogel natural e collangiocitos normais de ratos (NRC)s, como exemplo para o protocolo, mas outros hidrogéis naturais ou sintéticos, bem como células epiteliais poderiam ser usados para a formação de estruturas císticas 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para estudar a organogênese e a manutenção de estruturas celulares 3D, vários tecidos foram modelados, utilizando diferentes origens celulares, mas também diferentes tipos de matrizes extracelulares, incluindo hidrogéis sintéticos8,9,10,21. No entanto, devido à falta de análise quantitativa 3D que permita comparações entre métodos em termos de formação ou funcionalidade organoides…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Estados Unidos), que gentilmente forneceu a linha celular NRC.
Este trabalho recebeu o apoio financeiro tanto do programa iLite RHU (conceder ANR-16-RHUS-0005) quanto do DHU Hepatinov.
Agradecemos a Isabelle Garcin e Réseau d’Imagerie Cellulaire Paris Saclay pelo apoio à imagem.
Materials
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA – flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
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