Este protocolo permite la preparación de secciones transversales de semillas de cereales (por ejemplo, arroz) para el análisis de la morfología del endospermo y los gránulos de almidón mediante microscopía electrónica de barrido.
Los gránulos de almidón (SG) exhiben diferentes morfologías dependiendo de la especie de planta, especialmente en el endospermo de la familia Poaceae. El fenotipo de endospermo se puede utilizar para clasificar genotipos basados en el morfotipo SG utilizando el análisis microscópico electrónico de barrido (SEM). Los SG se pueden visualizar utilizando SEM cortando a través del núcleo (pericarpio, capas de aleurona y endospermo) y exponiendo el contenido organelar. Los métodos actuales requieren que el grano de arroz se incruste en resina plástica y se seccione con un microtomo o se incruste en una punta de pipeta truncada y se seccione a mano con una cuchilla de afeitar. El primer método requiere equipo especializado y requiere mucho tiempo, mientras que el segundo introduce una nueva serie de problemas dependiendo del genotipo del arroz. Las variedades de arroz calcáreo, en particular, representan un problema para este tipo de seccionamiento debido a la naturaleza friable de su tejido endospermo. Aquí se presenta una técnica para preparar secciones de granos de arroz translúcidas y calcáreas para microscopía, que requiere solo puntas de pipeta y una hoja de bisturí. La preparación de las secciones dentro de los límites de la punta de una pipeta evita que el endospermo del grano de arroz se rompa (para fenotipos translúcidos o “vítreos”) y se desmorone (para fenotipos calcáreos). Usando esta técnica, se puede observar el patrón de células de endospermo y la estructura de los SG intactos.
Los gránulos de almidón (SG) exhiben diferentes morfologías dependiendo de la especie vegetal, especialmente en el endospermo de la familia Poaceae 1,2. El fenotipo de endospermo se puede utilizar para clasificar genotipos basados en el fenotipo SG utilizando el análisis microscópico electrónico de barrido. Los SG se pueden visualizar utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) cortando el núcleo y haciendo palanca en las paredes celulares del endospermo2.
El propósito de esta técnica es preparar fácilmente secciones transversales de granos de arroz únicamente para el análisis rápido de SEM. El desarrollo de esta técnica fue motivado por la necesidad de un enfoque de sección transversal rápida mediante el cual las muestras se preparan para la microscopía SEM inmediatamente antes de la visualización utilizando un equipo mínimo.
Esta técnica consiste en la inserción del grano de arroz descascarillado en la punta de la pipeta para una inmovilización completa. Esto es particularmente importante cuando se sección transversal de fenotipos de granos de arroz calcáreos, que son friables y se desmoronan fácilmente bajo presión3. La cizalladura es una cualidad indeseable en el arroz, ya que afecta la apariencia del grano y hace que el grano se rompa fácilmente durante el pulido y la molienda3. La tiza se presenta como un área opaca en una sección transversal del grano que se puede observar a simple vista; a nivel microscópico, la cizalladura se caracteriza por gránulos de almidón pequeños y poco empaquetados. Las causas de la calcárea pueden sergenéticas4,5 oambientales6,7.
Las secciones transversales de semillas de cereales se han preparado tradicionalmente utilizando métodos de fijación química y seccionamiento después de la incrustación de la muestra en cera de parafina u otra matriz sólida4,8,9,10. En 2010, se introdujo el método Matsushima como una forma de evitar la complicada y lenta preparación de muestras de grano de arroz4. Este método implicaba la inserción del grano de arroz descascarillado en una punta de pipeta truncada. La punta se mantiene estacionaria mediante un recortador de bloques, y las secciones delgadas y parciales de endospermo se cosechan con una cuchilla de afeitar de mano. Otra técnica rápida desarrollada en 2016 permitió la sección completa delgada de una amplia variedad de semillas secas, incluidas las variedades calcáreas10. Estos métodos motivaron el desarrollo de la técnica rápida presentada aquí.
Esta nueva técnica es apropiada para los investigadores que desean obtener secciones transversales transversales intactas de granos de arroz para el fenotipado de endospermo y el análisis de la morfología del almidón utilizando SEM.
Este protocolo representa una adaptación del método4de punta de pipeta truncada de Matsushima, con varias modificaciones notables: (1) los núcleos no se absorben en ningún punto de la técnica; (2) no se requiere ni un recortador de bloques ni un ultramicrotomo para preparar las secciones. En este estudio se examinaron un cultivar “translúcido” de tipo silvestre(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) y una línea mutagenizada “calcárea” de Nipponbare(ssg1,grano de almidón de calidad inferior1)4. Estos dos cultivares fueron seleccionados para el análisis aquí para demostrar las diferencias técnicas y visuales en el procesamiento de secciones de arroz translúcidas y calcáreas.
La técnica presentada aquí representa un enfoque rápido, simple y agudo hacia la preparación de secciones transversales de arroz transversales para la visualización SEM de escritorio. Esta técnica de seccionamiento permite la observación rápida de la estructura del endospermo, la forma, el tamaño y el patrón de las células del endospermo, los gránulos compuestos y la morfología del almidón. A los efectos del fenotipado del endospermo y el cribado de germoplasma, es fundamental obtener una sección transversal completa del grano de arroz4,23,24. Es primordial insertar el grano completamente dentro de la punta de la pipeta para evitar que la presión de la hoja del bisturí obligue al endospermo a desmoronarse o romperse. Siempre que el conjunto del “telescopio” esté construido correctamente, las muestras se pueden preparar para su visualización en 15 segundos(Tabla 2)empleando materiales que ya están en la mano en un entorno de laboratorio típico. Esta técnica es aplicable a la sección transversal de cualquier semilla elipsoidal de aproximadamente cuatro milímetros de diámetro en su punto más ancho. Las semillas de la hierba modelo Brachypodium distachyon (Figura S2A) pueden seccionarse de manera similar, pero no permanecen encerradas dentro del anillo. Las semillas más grandes, como el trigo, se fracturan fácilmente y requieren cuidado al seccionar (Figura S2B).
Sin embargo, hay varias limitaciones a la técnica presentada aquí. Las secciones obtenidas utilizando esta técnica no son lo suficientemente delgadas para que la luz pase a través de lo que prohíbe el uso de esta técnica para enfoques microscópicos basados en la luz transmitida como el campo brillante (500 μm de espesor máximo de muestra para las secciones25del grano de arroz) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) (espesor máximo de muestra de 500 nm26 ). El uso de una punta de pipeta como la “matriz” de seccionamiento también limita el tamaño de la semilla que se puede seccionar utilizando esta técnica. Se requeriría una mayor solución de problemas para adaptar esta técnica para especies muy diferentes del arroz, y el tamaño de la “matriz” está limitado por el tamaño de las puntas de pipeta disponibles para la compra.
Otra ventaja distintiva que proporciona esta técnica es la calidad de las muestras que se pueden producir a partir de granos de arroz de fenotipo calcáreo. Vale la pena señalar que incluso el estudio de Matsushima admitió que era difícil obtener secciones transversales utilizando ese método particular para los fenotiposcalcáreos 4,como se replica en este estudio con el propósito de comparar(Figura 1S). En su caso, se hizo necesario fijar químicamente sus muestras de arroz calcáreo e incrustarlas en resina para su seccionamiento. La nueva técnica, junto con imágenes SEM de escritorio, permite al investigador preparar fácilmente secciones transversales de granos de arroz para microscopía con más consistencia que sin soporte de inmovilización(Tabla 3).
En la nueva era de la fenómica y la metabolómica, es importante monitorear las líneas mutagenizadas y las bibliotecas etiquetadas con transposones para comprender mejor la función y la importancia del almidón en las semillas. Además, el Banco Internacional de Germoplasma del Arroz posee más de 130 000 accesiones de arroz27. Una técnica rápida de fenotipado de semillas como la que aquí se presenta aceleraría la clasificación y el muestreo para la calidad nutricional28. Por último, esta técnica puede ser útil a la luz de los impactos del cambio climático invasor. El estrés estacional a altas temperaturas durante el llenado de granos ya se había identificado como una de las principales causas de la calcárea6, pero estudios recientes han implicado el aumento de las temperaturas globales en el aumento de la calcificación de los rendimientos de arroz7,29. Tal fenotipo acelerado del endospermo puede ayudar a proporcionar una imagen agrícola amplia del efecto del aumento de las temperaturas globales.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Systems for Research (SFR Corp.) por el uso de su instrumento Phenom ProX Desktop SEM, así como por la asistencia técnica proporcionada por Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) y Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Facultad de Medicina, Universidad de Ottawa). La financiación fue proporcionada por el Fondo de Innovación de Bajo Carbono (LCIF) del Ministerio de Desarrollo Económico, Creación de Empleo y Comercio del Gobierno de Ontario, y Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |