使用初级培养的希波坎帕神经元来研究Axon初始片段的组装
Summary
在这里，我们描述了一个协议，定量地研究海马神经元的轴向初始段 （AIS） 的组装和结构，由于没有一个巨大的安基林-G，缺乏预组装的 AIS。
Abstract
神经元轴星初始片段 （AIS） 是行动潜力的启动点，并对其分子结构、组装和活动依赖可塑性进行了广泛的研究。AIS的主要组织者巨型安基林-G直接与膜跨电压门控钠（VSVG）和钾通道（KCNQ2/3）以及186 kDa神经法辛（L1CAM细胞粘附分子）关联。巨型安基林-G还与细胞质AIS分子结合并招募，包括β-4-光谱素，以及微管结合蛋白EB1/EB3和Ndel1。巨型安基林-G足以在安基林-G缺乏神经元中拯救AIS的形成。Ankyrin-G 还包括一个较小的 190 kDa 等位体，位于树突状脊柱，而不是 AIS，它无法瞄准 AIS 或在安基林 – G 缺乏神经元中拯救 AIS。在这里，我们描述了一个协议，使用培养海马神经元从ANK3-E22/23-flox小鼠，当与Cre-BFP的传输显示失去所有同位素-G和损害AIS的形成。 结合经过改造的银行家胶质/神经元共培养系统，我们开发了一种用480 kDa安基林-G-GFP质粒来传输安基林-G空神经元的方法，这足以挽救AIS的形成。我们进一步采用了由Salzer及其同事开发的量化方法，以处理AIS与海马神经元培养物中发生的神经元细胞体距离的变化。该协议允许对 AIS 的无组件和动态行为进行定量研究。
Introduction
轴向初始段位于大多数脊椎动物神经元的近轴。在功能上，AIS 是由于该地区电压门钠通道的高密度而启动行动潜力的地方。一些兴奋神经元的AIS也通过形成GABAergic突触1，2，3成为抑制性内质体的目标。因此，AIS 是集成细胞信号和调节神经元兴奋性的关键站点。AIS 通常长度为 20-60 μm，位于细胞体的 20μm 范围内。AIS的长度和位置在大脑区域的神经元以及同一神经元4、5的不同发育阶段各不相同。累积的证据表明，AIS的组成和位置是动态的，以响应神经元活动的变化4，5，6，7。
480 kDa安基林-G是AIS的主要组织者。480 kDa 安基林-G 是一种膜相关适配器蛋白，直接与电压门控钠通道以及其他主要 AIS 蛋白质（包括β4-spectrin） 结合， KCNQ2/3 通道调节钠通道活性8、9和 186 kDa 神经法辛，L1CAM 将 GABAergic 突触导导到 AIS2、10。480 kDa 安基林-G 共享在短 190 kDa 安基林-G 等形形式 （ANK 重复， 幽灵绑定域， 监管域） 中发现的规范安基林域， 但由一个巨大的外显子区分， 只存在于脊椎动物中， 并特别表示在神经元 （图 1A）11，12。AIS形成12需要480 kDa安基林-G神经元特定域（NSD）。190 kDa 安基林-G 不促进 AIS 组装或目标 AIS 在安基林 – G – 空神经元12。然而，190 kDa安基林-G集中在AIS包含480千达安基林-G12。190 kDa 安基林-G 瞄准野生类型神经元预组装 AIS 的能力在文献中引起了混乱，并减缓了对 AIS 组装中 480 kDa ankyrin-G 关键专业功能的欣赏。因此，在缺乏预组装AIS的安基林-G-空神经元中研究AIS组件至关重要。
在这里，我们提出了一种方法，利用来自ANK3-E22/23-flox小鼠的培养海马神经元来研究AIS的组装和结构，该神经元消除了安基林-G13的所有等形形式（图1B）。通过在AIS组装之前用Cre-BFP结构传输神经元，我们生成了完全缺乏AIS的安基林-G缺乏神经元（图1B，图2）。AIS 的组装在与 Cre-BFP 质粒共同传输 480 kDa 安基林 – G – GFP 质粒后完全获救。此方法提供了在非预组装 AIS 环境中研究 AIS 装配的方法。我们还修改了Gary Banker的胶质-神经元共同培养系统，没有使用抗生素，以前为胚胎日18神经元设计，用于产后小鼠神经元，并调整AIS量数方法，平均AIS测量从多个神经元，以正常化AIS14，15的变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
AIS 的大会由 480 kDa 安基林 – G 组织。然而，安基林-G具有较短的等形，可以瞄准野生型神经元的AIS，这可能导致难以解释AIS装配的结构功能分析。在这里，我们介绍了一种使用来自ANK3-E22/23-flox小鼠的神经元的方法，允许研究AIS的无结。 通过在 3 分与 Cre-BFP 传输，我们消除了安基林-G 的所有内源同位素。我们也可以共同翻译 480 kda 安基林 – G， 以拯救 Ais 的形成。这允许在一个干净的?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢加里·班克博士对神经元培养协议的建议。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所、美国国家卫生研究院的资助和乔治·巴特·盖勒教授职位（V.B）的支持。
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
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