使用定制的输送系统进行磁性纳米颗粒热疗的体外和体内输送
Summary
该协议提供了使用复杂的输送和监测系统准确输送磁性纳米颗粒热疗所需的技术和方法。
Abstract
热疗长期以来一直用于治疗癌症。技术从热铁棒的肿瘤内插入到全身递送的肿瘤抗体靶向磁性纳米颗粒，温度从39°C（发烧水平）到1，000°C（电灼），治疗时间从几秒钟到几小时不等。温度-时间关系（热剂量）决定了高热剂量导致组织消融和低热剂量导致亚致死效应的效果，例如血流量增加、药物积累和免疫刺激。目前最有前途的医学疗法之一是磁性纳米颗粒热疗（mNPH）。该技术涉及激活磁性纳米颗粒，该纳米颗粒可以通过非侵入性，无毒的交变磁场进行全身或肿瘤内递送。磁性纳米颗粒的大小、构造和关联以及磁场的频率和场强是主要的加热决定因素。我们开发了先进的仪器和技术，用于在大型和小型动物模型和培养细胞中提供可重复的磁性纳米颗粒热疗。这种方法在多个位置使用连续的实时温度监测，允许将明确定义的热剂量输送到目标组织（肿瘤）或细胞，同时限制非目标组织加热。精确控制和监测多个站点的温度，并使用行业标准算法（43 °C /CEM43 下的累积等效分钟数），可以准确测定和量化热剂量。我们的系统允许各种温度、热剂量和生物效应，是通过商业收购和内部工程和生物学开发相结合而开发的。该系统已经过优化，允许在离体、体外和体内技术之间快速转换。该协议的目标是演示如何设计，开发和实施有效的技术和系统，以提供可重复和准确的磁性纳米颗粒治疗（mNP）热疗。
Introduction
热疗历来用于癌症治疗，无论是单独使用还是与其他治疗联合使用。尽管它有很长的使用历史，但提供这种治疗的最有利方法仍在争论中，并且取决于疾病部位和位置。热疗方法包括微波、射频、聚焦超声、激光和金属纳米颗粒（如金或氧化铁）1，2，3，4。这些输送方法可以导致从发烧水平到数百摄氏度的一系列治疗温度。热疗的生物学效应主要取决于使用的温度和治疗的持续时间5。对于这份手稿和目的，我们专注于磁性纳米颗粒热疗（mNPH）。该方法允许使用无毒、FDA批准的氧化铁纳米颗粒进行集中，局部，良好监测和控制的温度变化。
其他热疗方式的一个缺陷是缺乏精确的细胞靶向;热疗没有固有的高治疗比例，因此，仔细的测温和靶向是必要的6.mNPH允许全身或肿瘤内注射mNPs，仅在mNPs所在的位置产生热量，从而直接针对肿瘤进行治疗。当磁性纳米颗粒位于细胞内部或外部时，mNPH可能有效。对于癌症治疗，mNPH的一般概述是注射磁性纳米颗粒（肿瘤内或静脉内），然后施加交变磁场，使纳米颗粒磁极不断重新排列，导致与纳米颗粒相关的细胞和组织的局部加热7，8.通过调整纳米颗粒的体积和交变磁场（AMF）的频率/强度，可以仔细控制组织内产生的温度。
这种治疗在靠近体表的肿瘤中效果很好，因为更深的肿瘤需要更强的AMF，因此涡流加热的风险增加9。有证据表明热疗在临床上被用作单一疗法，然而，通常热疗与放射治疗或化疗相结合，导致更有针对性的抗癌作用10，11，12。热疗与放疗联合使用的临床证据在先前的出版物13中进行了回顾。我们的实验室使用mNPH方法12，14，15成功治疗了各种动物，从小鼠到猪和自发性犬癌。该方案专为那些有兴趣研究局部热疗效果的人而设计，无论是单独使用还是与其他疗法联合使用。
热疗最重要的因素之一是能够实时测量和理解传递到靶标/肿瘤组织的热剂量。计算和比较剂量的标准方法是通过演示在43°C下加热的累积等效分钟数;该算法允许比较独立于输送系统、最高和最低温度（在特定范围内）和加热/冷却参数5，16 的剂量。CEM计算最适合39-57°C之间的温度5。例如，在我们进行的一些研究中，我们选择了CEM43 30的热剂量（即在43°C下30分钟）。选择这种剂量使我们能够在体外观察安全，有效的免疫遗传效应，无论是单独使用还是与单剂量辐射结合使用17。
对于磁性纳米颗粒热疗，在构建适当的输送系统时需要考虑几个因素。仪器设计包括重要的安全因素，例如使用冷却器来确保磁场输送设备即使在高功率下运行时也能保持冷却，以及故障安全程序，如果所有温度、功率评估和控制系统尚未激活，则防止系统打开。此外，对于体内和体外情况，需要考虑一些重要的生物学因素。使用培养细胞时，有必要在生长培养基中处理并保持一致的活温度，以避免可能影响结果的生理变化。对于单个纳米颗粒类型，在计算基于AMF的加热参数时，了解比吸收率（SAR）非常重要。同样，了解细胞和组织中的mNP / Fe浓度对于实现所需的加热是必需的也很重要。体内方法需要更加注重细节，因为在治疗期间必须将动物保持在麻醉下，并且在整个治疗过程中动物的核心体温保持在正常水平。允许动物的体温下降，就像在麻醉下发生的那样，会影响整体结果，相对于被治疗组织的热剂量。
在这篇手稿中，我们讨论了用于设计和构建多功能磁性纳米颗粒热疗系统的方法，以及需要考虑的重要使用因素。所描述的系统允许稳健、一致、生物学上适当、安全和控制良好的磁性纳米颗粒热疗输送。最后，应该注意的是，我们进行的mNPH研究通常涉及其他疗法，例如放疗，化学疗法和免疫疗法。为了使这些结果有意义，重要的是要确定传递的热量如何影响其他方式的功效和/或安全毒性（反之亦然）以及动物的健康。由于这个原因以及前面提到的剂量学和治疗情况，必须严格注意磁性纳米颗粒热疗的剂量精度以及连续的核心和目标温度测量。该协议的目标是为输送安全有效的磁性纳米颗粒热疗提供一种简单，一致的方法和描述。
Protocol
Representative Results
Discussion
该系统的设计和实施提供了进行准确和可重现的体外和体内磁性纳米颗粒热疗实验的能力。至关重要的是，该系统的设计使AMF频率和场强与磁性纳米颗粒类型，浓度以及所需的组织位置和温度充分匹配。此外，实时精确监测温度对于安全和计算准确的热剂量（43 °C/CEM 下的累积当量分钟）至关重要。如图1所示，探头的放置允许实时监测热剂量和核心体温，如图<strong class="xfig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究由资助号资助：NCI P30 CA023108和NCI U54 CA151662。
Materials
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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