特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達
Summary
このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。
Abstract
温熱療法は癌の治療に長い間使用されてきました。技術は、高温の鉄棒の腫瘍内挿入から、39°C(発熱レベル)から1,000°C(電気焼灼)の温度および数秒から数時間の治療時間での全身送達腫瘍抗体標的磁性ナノ粒子までさまざまです。温度-時間関係(熱線量)は、組織のアブレーションをもたらす高熱線量と、血流の増加、薬物の蓄積、免疫刺激などの亜致死効果をもたらす低熱線量での効果を決定します。現在最も有望な治療法の1つは、磁性ナノ粒子温熱療法(mNPH)です。この技術は、非侵襲的、非毒性の交流磁場で全身的または腫瘍内に送達され得る磁性ナノ粒子を活性化することを含む。磁性ナノ粒子のサイズ、構造、会合、および磁場の周波数と電界強度は、主要な加熱決定要因です。私たちは、大小動物モデルや培養細胞に再現性のある磁性ナノ粒子ハイパーサーミアを提供するための高度な機器と技術を開発しました。このアプローチは、複数の場所で継続的なリアルタイムの温度モニタリングを使用して、非標的組織の加熱を制限しながら、標的組織(腫瘍)または細胞に明確に定義された熱線量を送達することを可能にします。複数のサイトでの温度の正確な制御と監視、および業界標準のアルゴリズム(43°C/CEM43での累積等価分)の使用により、熱線量の正確な決定と定量化が可能になります。さまざまな温度、熱線量、生物学的効果を可能にする当社のシステムは、商業的買収と社内のエンジニアリングおよび生物学の開発を組み合わせて開発されました。このシステムは、エキソビボ、インビトロ、およびインビボ技術間の迅速な変換を可能にする方法で最適化されています。このプロトコルの目的は、再現性のある正確な磁性ナノ粒子療法(mNP)温熱療法を提供するための効果的な技術とシステムを設計、開発、および実装する方法を実証することです。
Introduction
温熱療法は歴史的に、単独で、または他の治療法と組み合わせて、癌治療に使用されてきました。それは長い使用の歴史を持っていますが、この治療を提供するための最も有利な方法はまだ議論されており、病気の部位と場所に依存します。温熱伝導の方法には、マイクロ波、高周波、集束超音波、レーザー、および金属ナノ粒子(金や酸化鉄など)が含まれます1,2,3,4。これらの送達方法は、発熱レベルから数百°Cまでの範囲の治療温度につながる可能性があります。温熱療法の生物学的効果は、主に使用される温度と治療期間に依存します5。この論文と目的のために、磁性ナノ粒子ハイパーサーミア(mNPH)に焦点を当てています。この方法では、毒性のないFDA承認の酸化鉄ナノ粒子を使用して、焦点を絞って局所化し、十分に監視し、制御した温度変化を可能にします。
他の温熱療法の落とし穴の1つは、正確な細胞ターゲティングの欠如です。温熱療法は本質的に高い治療比を持たないため、慎重な体温測定とターゲティングが必要です6。mNPHは、mNPの全身的または腫瘍内注射を可能にし、mNPが位置する場所でのみ熱が発生するため、腫瘍に直接治療を標的にします。mNPHは、磁性ナノ粒子が細胞の内側または外側にある場合に有効です。癌治療の場合、mNPHの一般的な概要は、磁性ナノ粒子が注入され(腫瘍内または静脈内に)、次に交番磁場が印加され、ナノ粒子磁極が絶えず再整列し、ナノ粒子に関連する細胞および組織の局所的な加熱をもたらすことです7,8.ナノ粒子の体積と交流磁場(AMF)の周波数/強度を調整することにより、組織内で発生する温度を注意深く制御することができます。
この治療法は、より深い腫瘍がより強いAMFを必要とするため、渦電流加熱のリスクが高まるため、体表面近くの腫瘍でうまく機能します9。ハイパーサーミアが単剤療法として臨床的に使用されているという証拠がありますが、多くの場合、ハイパーサーミアは放射線療法または化学療法と組み合わされ、より標的を絞った抗がん効果につながります10,11,12。放射線療法と組み合わせて機能する温熱療法の臨床的証拠は、以前の出版物でレビューされています13。私たちの研究室では、mNPH法12,14,15を用いて、マウスからブタ、イヌの自然がんまで、さまざまな動物の治療に成功しています。このプロトコルは、単独で、または他の治療法と組み合わせて、局所的な温熱療法の効果を調査することに関心のある人のために設計されています。
温熱療法の最も重要な要素の1つは、標的/腫瘍組織に送達される熱線量をリアルタイムで測定および理解できることです。線量を計算および比較する標準的な方法は、43°Cでの加熱の累積等価分数のデモンストレーションによるものです。このアルゴリズムは、送達システム、最高温度および最低温度(特定の範囲内)、および加熱/冷却パラメータ5,16とは無関係の用量の比較を可能にする。CEM計算は、39〜57°C5の温度に最適です。たとえば、私たちが実施したいくつかの研究では、CEM43 30(つまり、43°Cで30分)の熱線量を選択しました。この線量を選択することで、単独で、または単回線量の放射線と組み合わせて、in vitroで安全で効果的な免疫遺伝学的効果を調べることができました17。
磁性ナノ粒子温熱療法では、適切な送達システムを構築する際に考慮する必要があるいくつかの要因があります。計装設計には、高電力で動作している場合でも磁場供給装置を冷却するためのチラーの使用や、すべての温度、電力評価、および制御システムがアクティブになっていない場合にシステムの電源がオンにならないようにするフェイルセーフ手順など、重要な安全要素が含まれています。さらに、in vivoとin vitroの両方の状況で考慮する必要がある重要な生物学的要因があります。培養細胞を使用する場合、結果に影響を与える可能性のある生理学的変化を避けるために、増殖培地で処理し、一定の生菌温度に維持する必要があります。個々のナノ粒子タイプについては、AMFベースの加熱パラメータを計算する際に比吸収率(SAR)を知ることが重要です。同様に、所望の加熱を達成するために必要な細胞および組織中のmNP/Fe濃度を知ることも重要である。in vivo法では、治療中は動物を麻酔下で維持し、治療中は動物の深部体温を正常なレベルに維持する必要があるため、細部にさらに注意を払う必要があります。麻酔下で起こるように、動物の体温を下げることを許容することは、治療される組織の熱線量に関して、全体的な結果に影響を与える可能性があります。
この原稿では、汎用性の高い磁性ナノ粒子ハイパーサーミアシステムの設計と構築に使用される方法と、考慮する必要のある重要な使用要因について説明します。記載されたシステムは、磁性ナノ粒子温熱療法の堅牢で、一貫性があり、生物学的に適切で、安全で、十分に制御された送達を可能にする。最後に、私たちが実施するmNPH研究には、放射線療法、化学療法、免疫療法などの他の治療法が含まれることが多いことに注意してください。これらの結果が意味のあるものであるためには、供給された熱が他のモダリティの有効性および/または安全性毒性(またはその逆)および動物の幸福にどのように影響するかを判断することが重要です。このため、前述の線量測定および治療状況のために、磁性ナノ粒子温熱療法の投与精度と連続的なコアおよびターゲット温度測定に厳密に注意を払うことが不可欠です。このプロトコルの目標は、安全で効果的な磁性ナノ粒子温熱療法の送達のための簡単で一貫した方法と説明を提供することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
このシステムの設計と実装は、正確で再現性のあるin vitroおよびin vivo磁性ナノ粒子ハイパーサーミア実験を実施する能力を提供します。AMFの周波数と電界強度が磁性ナノ粒子の種類、濃度、および組織の位置と温度に適切に一致するようにシステムを設計することが重要です。さらに、リアルタイムで温度を正確に監視することは、安全性と正確な熱線量(43°C/ CEMでの累積等価分)の計算にと?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、助成金番号(NCI P30 CA023108およびNCI U54 CA151662)によって資金提供されました。
Materials
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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