Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado

Summary

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para a entrega precisa de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sofisticado sistema de entrega e monitoramento.

Abstract

A hipertermia tem sido usada há muito tempo no tratamento do câncer. As técnicas têm variado desde a inserção intratumoral de barras de ferro quente, até nanopartículas magnéticas direcionadas a anticorpos tumorais administradas sistemicamente, a temperaturas de 39 °C (nível de febre) a 1.000 °C (eletrocautério) e tempos de tratamento de segundos a horas. A relação temperatura-tempo (dose térmica) dita o efeito com altas doses térmicas, resultando na ablação tecidual e doses térmicas mais baixas, resultando em efeitos subletais, como aumento do fluxo sanguíneo, acúmulo de drogas e estimulação imunológica. Uma das terapias médicas atuais mais promissoras é a hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica envolve a ativação de nanopartículas magnéticas, que podem ser entregues sistemicamente ou intratumoralmente, com um campo magnético alternado não invasivo e não tóxico. O tamanho, a construção e a associação das nanopartículas magnéticas e a frequência e a intensidade do campo magnético são os principais determinantes do aquecimento. Desenvolvemos instrumentação e técnicas sofisticadas para fornecer hipertermia de nanopartículas magnéticas reprodutíveis em modelos animais grandes e pequenos e células cultivadas. Essa abordagem, usando monitoramento contínuo e em tempo real da temperatura em vários locais, permite a entrega de doses térmicas bem definidas para o tecido alvo (tumor) ou células, limitando o aquecimento do tecido não alvo. O controle e o monitoramento precisos da temperatura, em vários locais, e o uso do algoritmo padrão da indústria (minutos equivalentes cumulativos a 43 °C /CEM43) permitem uma determinação e quantificação precisas da dose térmica. Nosso sistema, que permite uma ampla variedade de temperaturas, doses térmicas e efeitos biológicos, foi desenvolvido por meio de uma combinação de aquisições comerciais e desenvolvimentos internos de engenharia e biologia. Este sistema foi otimizado de uma forma que permite a rápida conversão entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. O objetivo deste protocolo é demonstrar como projetar, desenvolver e implementar uma técnica e um sistema eficazes para fornecer hipertermia reprodutível e precisa da terapia de nanopartículas magnéticas (mNP).

Introduction

A hipertermia tem sido historicamente usada na terapia do câncer, isoladamente ou em combinação com outros tratamentos. Embora tenha uma longa história de uso, o método mais vantajoso para a entrega deste tratamento ainda está sendo debatido e depende do local e localização da doença. Os métodos de entrega de hipertermia incluem micro-ondas, radiofrequência, ultrassom focalizado, laser e nanopartículas metálicas (como ouro ou óxido de ferro)1,2,3,4. Esses métodos de entrega podem levar a uma variedade de temperaturas de tratamento desde o nível da febre até centenas de graus C. O efeito biológico da hipertermia depende principalmente das temperaturas utilizadas e da duração do tratamento⁵. Para este manuscrito e propósito, estamos nos concentrando na hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite mudanças de temperatura focadas, localizadas, bem monitoradas e controladas, usando nanopartículas de óxido de ferro não tóxicas, aprovadas pela FDA.

Uma armadilha de outras modalidades de hipertermia é a falta de direcionamento celular preciso; a hipertermia não tem uma razão terapêutica inerentemente alta, portanto, é necessária uma termometria e direcionamento cuidadosos⁶. A mNPH permite a injeção sistêmica ou intratumoral de mNPs, com o calor sendo gerado apenas onde as mNPs estão localizadas, direcionando assim o tratamento diretamente para o tumor. O mNPH pode ser eficaz quando as nanopartículas magnéticas estão localizadas dentro ou fora da célula. Para a terapia do câncer, a visão geral da mNPH é que as nanopartículas magnéticas são injetadas (intratumoral ou intravenosamente), em seguida, um campo magnético alternado é aplicado, fazendo com que os polos magnéticos das nanopartículas se realinhem constantemente, levando a um aquecimento localizado das células e tecidos associados às nanopartículas ^7,8 . Ajustando o volume de nanopartículas e a frequência/intensidade do campo magnético alternado (FMA), é possível controlar cuidadosamente a temperatura gerada dentro do tecido.

Esse tratamento funciona bem em tumores que estão próximos à superfície corporal, pois tumores mais profundos requerem FMA mais forte, de modo que o risco de aquecimento por correntes parasitas aumenta⁹. Há evidências de hipertermia sendo utilizada clinicamente como monoterapia, no entanto, muitas vezes a hipertermia é combinada com radioterapia ou quimioterapia, levando a um efeito anticâncer mais direcionado^10,11,12. Evidências clínicas de hipertermia trabalhando em combinação com radioterapia são revisadas em publicação anterior¹³. Nosso laboratório tem tratado com sucesso uma variedade de animais, de camundongos a porcos e cânceres caninos espontâneos, utilizando o método mNPH^12,14,15. Este protocolo é projetado para aqueles interessados em investigar os efeitos do tratamento da hipertermia localizada, isoladamente ou em combinação com outras terapias.

Um dos fatores mais importantes na hipertermia é ser capaz de medir e entender, em tempo real, a dose térmica que está sendo entregue ao tecido alvo / tumoral. Uma forma normalizada de calcular e comparar a dose é através da demonstração dos minutos equivalentes cumulativos de aquecimento a 43 °C; esse algoritmo permite a comparação de doses independentes do sistema de entrega, temperaturas máximas e mínimas (dentro de uma faixa específica) e parâmetros de aquecimento/resfriamento ^5,16. O cálculo CEM funciona melhor para temperaturas entre 39-57 °C⁵. Por exemplo, em alguns dos estudos que realizamos, escolhemos uma dose térmica de CEM43 30 (ou seja, 30 min a 43 °C). A escolha dessa dose permitiu observar efeitos imunogenéticos seguros, eficazes e in vitro, tanto isoladamente quanto em combinação com uma dose única de radiação¹⁷.

Com a hipertermia de nanopartículas magnéticas, existem vários fatores que precisam ser considerados na construção de um sistema de entrega apropriado. O projeto de instrumentação inclui importantes fatores de segurança, como o uso de um resfriador para garantir que o equipamento de entrega de campo magnético permaneça frio mesmo quando operado em alta potência e procedimentos à prova de falhas que impedem que o sistema seja ligado se todos os sistemas de temperatura, avaliação de energia e controle não tiverem sido ativados. Além disso, existem fatores biológicos importantes que precisam ser considerados para situações in vivo e in vitro. Ao usar células cultivadas, é necessário tratar em meios de crescimento e manter a uma temperatura viável consistente para evitar alterações fisiológicas que possam afetar os resultados. Para tipos individuais de nanopartículas, é importante conhecer a taxa de absorção específica (SAR) ao calcular os parâmetros de aquecimento baseados em FMA. Da mesma forma, é importante conhecer a concentração de mNP/Fe, em células e tecidos, que é necessária para alcançar o aquecimento desejado. Os métodos in vivo requerem ainda mais atenção aos detalhes, uma vez que o animal deve ser mantido sob anestesia durante o tratamento e a temperatura corporal central do animal mantida em um nível normal durante todo o tratamento. Permitir que a temperatura corporal do animal caia, como acontece sob anestesia, pode afetar os resultados gerais, no que diz respeito à dose térmica do tecido a ser tratado.

Neste manuscrito, discutimos os métodos utilizados para projetar e construir um versátil sistema de hipertermia de nanopartículas magnéticas, bem como importantes fatores de uso que precisam ser considerados. O sistema descrito permite a entrega robusta, consistente, biologicamente apropriada, segura e bem controlada da hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, deve-se notar que os estudos de mNPH que conduzimos geralmente envolvem outras terapias, como radiação, quimioterapia e imunoterapia. Para que esses resultados sejam significativos, é importante determinar como o calor fornecido pode afetar a eficácia e/ou a toxicidade de segurança de outras modalidades (ou vice-versa) e o bem-estar do animal. Por esta razão e pela dosimetria e situações terapêuticas anteriormente mencionadas, é essencial prestar muita atenção à precisão da dosagem de hipertermia de nanopartículas magnéticas e às medições contínuas de temperatura central e alvo. O objetivo deste protocolo é fornecer um método e uma descrição simples e consistentes para a entrega de hipertermia segura e eficaz de nanopartículas magnéticas.

Protocol

O Dartmouth College Animal Care and Use Program é credenciado pela American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e adere a todas as diretrizes e regulamentos da UDSA e do NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Todos os estudos in vivo foram aprovados pelo Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O procedimento de eutanásia adere às Diretrizes da AVMA de 2020 para a Eutanásia de Animais. 1. Instrumentação/concepçã…

Representative Results

Estudos in vitroAs células só alcançarão e manterão a temperatura e a dose térmica desejadas se a quantidade e a concentração das nanopartículas magnéticas/ferro e do FMA forem adequadamente combinadas. Ao usar nanopartículas magnéticas para aquecer células in vitro (e in vivo), deve-se notar que, para alcançar a hipertermia em células com nanopartículas magnéticas internalizadas, será necessário um nível específico de mNP/Fe intracelular, e o número e a proximidade de células …

Discussion

O projeto e a implementação deste sistema fornecem a capacidade de conduzir experimentos precisos e reprodutíveis de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. É fundamental que o sistema seja projetado de tal forma que a frequência e a intensidade do campo AMF sejam adequadamente combinadas com o tipo de nanopartícula magnética, a concentração e a localização e temperatura do tecido desejadas. Além disso, o monitoramento preciso da temperatura em tempo real é crucial para a segurança e …

Materials

.25% Trypsin	Corning	45000-664	available from many companies
1.5 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf 22363204	available from many companies
B16F10 murine melanoma cells	American Type Culture Collection	CRL-6475
C57/Bl6 mice	Charles river	027C57BL/6	6-week-old female mice
Chiller	Thermal Care	NQ 5 series	chiller that cools the coil
Coolant fluid	Dow Chemical Company	Dowtherm SR-1	antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum	Hyclone	SH30071	available from many companies
fiber optic probes, software and chassis	FISO		FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera	Flir		infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid	Fluxtrol	custom built
penicillin/streptomycin	Corning	45000-652	available from many companies
RF generator	Huttinger	TIG 10/300	power source
RPMI media	Corning	45000-396	available from many companies