Entrega in vitro e in vivo de hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sistema de administración personalizado
Summary
Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la entrega precisa de la hipertermia de nanopartículas magnéticas utilizando un sofisticado sistema de entrega y monitoreo.
Abstract
La hipertermia se ha utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento del cáncer. Las técnicas han variado desde la inserción intratumoral de barras de hierro calientes, hasta nanopartículas magnéticas dirigidas a anticuerpos tumorales administradas sistémicamente, a temperaturas de 39 ° C (nivel de fiebre) a 1.000 ° C (electrocauterio) y tiempos de tratamiento de segundos a horas. La relación temperatura-tiempo (dosis térmica) dicta el efecto con altas dosis térmicas que resultan en la ablación tisular y dosis térmicas más bajas que resultan en efectos subletales como aumento del flujo sanguíneo, acumulación de medicamentos y estimulación inmune. Una de las terapias médicas actuales más prometedoras es la hipertermia por nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica consiste en activar nanopartículas magnéticas, que pueden administrarse sistémica o intratumoralmente, con un campo magnético alterno no invasivo y no tóxico. El tamaño, la construcción y la asociación de las nanopartículas magnéticas y la frecuencia y la intensidad de campo del campo magnético son los principales determinantes del calentamiento. Hemos desarrollado instrumentación y técnicas sofisticadas para administrar hipertermia de nanopartículas magnéticas reproducibles en modelos de animales grandes y pequeños y células cultivadas. Este enfoque, que utiliza un monitoreo continuo de la temperatura en tiempo real en múltiples ubicaciones, permite la administración de dosis térmicas bien definidas al tejido o células diana (tumor) al tiempo que limita el calentamiento del tejido no objetivo. El control y monitoreo precisos de la temperatura, en múltiples sitios, y el uso del algoritmo estándar de la industria (minutos equivalentes acumulados a 43 ° C / CEM43), permite una determinación y cuantificación precisas de la dosis térmica. Nuestro sistema, que permite una amplia variedad de temperaturas, dosis térmicas y efectos biológicos, se desarrolló a través de una combinación de adquisiciones comerciales y desarrollos internos de ingeniería y biología. Este sistema ha sido optimizado de una manera que permite la rápida conversión entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo diseñar, desarrollar e implementar una técnica y un sistema efectivos para administrar hipertermia de terapia de nanopartículas magnéticas (mNP) reproducible y precisa.
Introduction
La hipertermia se ha utilizado históricamente en la terapia del cáncer, ya sea sola o en combinación con otros tratamientos. Aunque tiene una larga historia de uso, el método más ventajoso para administrar este tratamiento aún se está debatiendo y depende del sitio y la ubicación de la enfermedad. Los métodos para la administración de hipertermia incluyen microondas, radiofrecuencia, ultrasonido focalizado, láser y nanopartículas metálicas (como oro u óxido de hierro)1,2,3,4. Estos métodos de administración pueden conducir a un rango de temperaturas de tratamiento desde el nivel de fiebre hasta cientos de grados C. El efecto biológico de la hipertermia depende principalmente de las temperaturas utilizadas y de la duración del tratamiento5. Para este manuscrito y propósito, nos estamos centrando en la hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite cambios de temperatura enfocados, localizados, bien monitoreados y controlados, utilizando nanopartículas de óxido de hierro no tóxicas, aprobadas por la FDA.
Una trampa de otras modalidades de hipertermia es la falta de orientación celular precisa; La hipertermia no tiene una relación terapéutica inherentemente alta, por lo tanto, es necesaria una termometría cuidadosa y una focalización6. mNPH permite la inyección sistémica o intratumoral de mNPs, y el calor solo se genera donde se encuentran los mNPs, dirigiendo así el tratamiento directamente al tumor. mNPH puede ser eficaz cuando las nanopartículas magnéticas se encuentran dentro o fuera de la célula. Para la terapia del cáncer, la visión general de mNPH es que las nanopartículas magnéticas se inyectan (intratumoral o intravenosamente), luego se aplica un campo magnético alterno, lo que hace que los polos magnéticos de nanopartículas se realineen constantemente, lo que lleva a un calentamiento localizado de las células y tejidos asociados con las nanopartículas 7,8 . Al ajustar el volumen de nanopartículas y la frecuencia / fuerza del campo magnético alterno (AMF), es posible controlar cuidadosamente la temperatura generada dentro del tejido.
Este tratamiento funciona bien en tumores que están cerca de la superficie del cuerpo, ya que los tumores más profundos requieren una AMF más fuerte, por lo que el riesgo de calentamiento por corrientes de Foucault aumenta9. Existe evidencia de que la hipertermia se utiliza clínicamente como monoterapia, sin embargo, a menudo la hipertermia se combina con radioterapia o quimioterapia, lo que lleva a un efecto anticancerígeno más dirigido10,11,12. La evidencia clínica de hipertermia que funciona en combinación con radioterapia se revisa en una publicación anterior13. Nuestro laboratorio ha tratado con éxito una variedad de animales, desde ratones hasta cerdos y cánceres caninos espontáneos, utilizando el método mNPH12,14,15. Este protocolo está diseñado para aquellos interesados en investigar los efectos del tratamiento de la hipertermia localizada, ya sea solo o en combinación con otras terapias.
Uno de los factores más importantes en la hipertermia es poder medir y comprender, en tiempo real, la dosis térmica que se administra al tejido diana/tumoral. Una forma estándar de calcular y comparar la dosis es mediante la demostración de los minutos equivalentes acumulados de calentamiento a 43 °C; Este algoritmo permite la comparación de dosis independientes del sistema de administración, temperaturas máximas y mínimas (dentro de un rango específico) y parámetros de calentamiento / enfriamiento 5,16. El cálculo CEM funciona mejor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por ejemplo, en algunos de los estudios que hemos realizado, hemos elegido una dosis térmica de CEM43 30 (es decir, 30 min a 43 °C). La elección de esta dosis nos permitió observar efectos inmunogenéticos seguros y efectivos in vitro, tanto solos como en combinación con una sola dosis de radiación17.
Con la hipertermia de nanopartículas magnéticas, hay varios factores que deben considerarse en la construcción de un sistema de administración apropiado. El diseño de la instrumentación incluye importantes factores de seguridad, como el uso de un enfriador para garantizar que el equipo de suministro de campo magnético permanezca frío incluso cuando se opera a alta potencia, y procedimientos a prueba de fallas que evitan que el sistema se encienda si no se han activado todos los sistemas de temperatura, evaluación de potencia y control. Además, hay factores biológicos importantes que deben considerarse tanto para situaciones in vivo como in vitro. Cuando se utilizan células cultivadas, es necesario tratar en medios de crecimiento y mantener a una temperatura viable constante para evitar cambios fisiológicos que podrían afectar los resultados. Para los tipos de nanopartículas individuales, es importante conocer la tasa de absorción específica (SAR) al calcular los parámetros de calentamiento basados en AMF. Del mismo modo, es importante conocer la concentración de mNP/Fe, en células y tejidos, que es necesaria para lograr el calentamiento deseado. Los métodos in vivo requieren aún más atención a los detalles, ya que el animal debe mantenerse bajo anestesia durante el tratamiento y la temperatura corporal central del animal debe mantenerse a un nivel normal durante todo el tratamiento. Permitir que la temperatura corporal del animal baje, como sucede bajo anestesia, puede afectar los resultados generales, con respecto a la dosis térmica del tejido que se está tratando.
En este manuscrito, discutimos los métodos utilizados para diseñar y construir un sistema versátil de hipertermia de nanopartículas magnéticas, así como los factores de uso importantes que deben considerarse. El sistema descrito permite la entrega robusta, consistente, biológicamente apropiada, segura y bien controlada de la hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, debe tenerse en cuenta que los estudios de mNPH que realizamos a menudo involucran otras terapias como radiación, quimioterapia e inmunoterapia. Para que estos resultados sean significativos, es importante determinar cómo el calor suministrado puede afectar la eficacia y/o seguridad-toxicidad de otras modalidades (o viceversa) y el bienestar del animal. Por esta razón y las situaciones dosimétricas y terapéuticas mencionadas anteriormente, es esencial prestar estricta atención a la precisión de la dosificación de hipertermia de nanopartículas magnéticas y las mediciones continuas del núcleo y la temperatura objetivo. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método y una descripción sencillos y consistentes para la administración de hipertermia de nanopartículas magnéticas segura y efectiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
El diseño y la implementación de este sistema proporciona la capacidad de realizar experimentos precisos y reproducibles de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. Es fundamental que el sistema esté diseñado de tal manera que la frecuencia AMF y la intensidad de campo se ajusten adecuadamente al tipo de nanopartícula magnética, la concentración y la ubicación y temperatura del tejido deseadas. Además, el monitoreo preciso de la temperatura en tiempo real es crucial para la seguridad y el c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue financiado por los números de subvención: NCI P30 CA023108 y NCI U54 CA151662.
Materials
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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