מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי
Summary
סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.
Abstract
זרימת עבודה של PCR (mdPCR) של טיפות מרובות ופרוטוקול מפורט לקביעת ספירת תאי דם לבנים מבוססי אפיגנטיקה (WBC) מתוארת, יחד עם התקן ייצור טיפות מיקרופלויד (TPE) תרמופלסטי. סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תת-תחליף WBC שהוא בעל ערך פרוגנוסטי חשוב במחלות שונות. זה מושגת באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA של אזורים ספציפיים עשירים CG בגנום (CpG loci). בנייר זה, ביסובפיט שטופלו DNA מתאי דם היקפיים מונונוקולריים (PBMCs) הוא עטוף טיפות עם reagents mdPCR כולל פריימרים ובדיקות הידרוליזה פלורסנט ספציפי עבור CpG loci כי לתאם עם אוכלוסיות משנה WBC. גישת המולטיפלקס מאפשרת חקירה של CpG loci רבים ללא צורך בתגובות MDPCR נפרדות, המאפשרת קביעה פרמטרית מדויקת יותר של תת-אוכלוסיות WBC באמצעות ניתוח אפיגנטי של אתרי מתילציה. כימות מדויקת זו יכולה להיות מורחבת ליישומים שונים ומדגישה את היתרונות לאבחון קליני ופרוגנוזה עוקבות.
Introduction
ניתוח של הרכב תאי דם לבנים (WBCs) הוא בין בדיקות המעבדה הנפוצות ביותר באבחון המטולוגי. ספירת לוקוציט דיפרנציאלית משמשת כאינדיקטור לספקטרום של מחלות כולל זיהום, דלקת, אנמיה, לוקמיה, והוא נמצא תחת חקירה כסמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם עבור מספר תנאים אחרים, כמו גם. תקן זהב ב-WBC subtyping כרוך בחיסונים ו/או ציתומיה זרימה ששניהם דורשים נוגדני פלורסנט יקרים, הנוטים לחוסר יציבות, ולעתים קרובות תלויים מאוד במיומנות המפעיל בהכנה לדוגמה. יתר על כן, שיטה זו ישימה לדגימות דם טריות בלבד, כך שלא ניתן להקפיא את הדגימות לצורך משלוח או ניתוח מאוחר יותר.
סמנים אפיגנטיים התגלו לאחרונה ככלים אנליטיים רבי עוצמה לחקר וריאציות פנוטיפיות. לאחר מכן, אוכלוסיות לוקוצייט אנושיות הראו שיש דפוסי מתילציה DNA lineage תא המאפשרים אפיון מדויק של ערכות משנה WBC. תת-ערך המבוסס על סמנים אפיגנטיים מספק אלטרנטיבה מבטיחה שאינו תלוי באיסוף דגימות דם טריות או נוגדנים יקרים, וניתן לנצלו כסמן ביולוגי לתחילת מחלותורגישות 1,,2,,3,,4,,5.
מחקרים גנומיים בוצעו עבור מיפוי נרחב של אזורים עשירים CG ספציפיים מתילציה בגנום (איי CpG) בתתי-סוגים של leukocyte כדי לזהות סמנים אפיגנטיים מועמד ספציפי תת סוגי לוקוצייט. פרוטוקולי PCR פותחו בשל סיבה זו עבור אזורי גנים מתילציה, למשל, CD3Z ו FOXP3, המתאימים CD3+ T-תאים ו- CD4+ CD25+ תאי T רגולטוריים (T-Regs), בהתאמה. Wiencke ואח ‘ הדגימו את השירות של PCR טיפות דופלקס עבור subtyping epigenetic של T-תאים, תוצאות מניבות כי מאוד לתאם עם זרימה מופעל תא מיון (FACS)ניתוח 6. שיטת ניתוח גנטי כמותי זה מסתמכת על חלוקה למחיצות מולקולות חומצה גרעין תבנית ריאגנטים PCR לאלפי דיסקרטי, מוגדר נפח, טיפות בגודל תת-nanoliter המכיל אפס, אחד או יותר עותקים חומצה גרעין היעד, באמצעות אמולסיות מים בשמן מופעל על ידי microfluidics7,8. ההגדלה PCR מתבצעת בתוך כל טיפה בודדת ועוצמת פלואורסצנטיות נקודת הקצה של כל טיפה נמדדת, ומאפשרת כימות מוחלטת של מטרות הנוכחיות בדגימה. Droplet PCR הוקמה כדי להיות מדויק יותר, מדויק, ומבחינה טכנית פשוט יותר מאשר qPCR סטנדרטי, מה שהופך אותו לשיטה נוחה יותר מבוססי מתילציה DNA להערכה קלינית של T-תאים. למרות מתודולוגיית תת-טיפוס המתפתחת במהירות, ניתוח אפיגנטי מרובה כדי לבדוק עבור אזורי CpG מתילציה שונים בו זמנית חסר. זה הכרחי לספירת דיפרנציאל לוקוצייט שגרתית.
בזאת, מכשיר מיקרו-נוזלים תרמופלסטי (TPE) טיפות טיפות מוצג ומועסק עבור מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR (mdPCR). הטכנולוגיה שימשה כדי לפרט סוגי משנה ספציפיים leukocyte, CD3+ T-תאים ו- CD4+ CD25+ T-Regs, בהתבסס על דפוסי מתילציה DNA של שושלת תאים, כלומר, וריאציה אפיגנטית של אזורי CD3Z ו FOXP3 CpG, בהתאמה. פרוטוקול מפורט עבור הפקת DNA, המרת בישולפיט ו- mdPCR מתואר בקונצרט עם שיטת ייצור עבור מכשיר דור טיפות TPE. התוצאות המייצגות של השיטה מושוות לאלה של כתמי חיסון המדגישים את התועלת של הגישה המוצעת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הניסיוני שהוצג ושיטות לאפשר mdPCR בתוך הבית באמצעות גנרטור טיפות TPE מפוברק, מחזור תרמי, מיקרוסקופ פלואורסציט. המכשיר המפוברק באמצעות TPE רך כדי TPE מליטה מאפשר מאפייני פני השטח הידרופוביים כי הם אחידים על פני כל קירות הערוץ, כך המכשיר הסופי אינו דורש כל טיפול פני השטח לשימוש הבא כמחול?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בתמיכה כספית ממועצת המחקר הלאומית של קנדה.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. . The Autoimmune Diseases. , (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
