Plasmodium falciparum Gametocytencultuur en muggeninfectie door kunstmatige membraanvoeding

Summary

Gedetailleerd onderzoek naar muggenstadia van malariaparasieten is van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve transmissieblokkeringsstrategieën. Dit protocol laat zien hoe infectieuze gametocyten effectief kunnen worden gekweekt en deze gametocyten vervolgens aan muggen kunnen worden gevoerd om muggenstadia van P. falciparumte genereren .

Abstract

Malaria blijft een van de belangrijkste problemen voor de volksgezondheid en veroorzaakt aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Malaria is een door muggen overgedragen ziekte die wordt overgedragen door een besmettelijke beet van de vrouwelijke Anopheles-mug. Malariabestrijding zal uiteindelijk afhankelijk zijn van een veelheid aan benaderingen, waaronder manieren om overdracht naar, door en van muggen te blokkeren. Om muggenstadia van malariaparasieten in het laboratorium te bestuderen, hebben we een protocol geoptimaliseerd om zeer besmettelijke Plasmodium falciparum-gametocyten te cultureren, een parasietstadium dat nodig is voor overdracht van de menselijke gastheer naar de muggenvector. P. falciparum gametocyten rijpen door vijf morfologisch verschillende stappen, wat ongeveer 1-2 weken duurt. Gametocytencultuur beschreven in dit protocol wordt voltooid in 15 dagen en is besmettelijk voor muggen van dag 15-18. Deze protocollen zijn ontwikkeld om een continue cyclus van infectie competente gametocyten te handhaven en om ononderbroken toevoer van muggenstadia van de parasiet te behouden. Hier beschrijven we de methodologie van gametocytencultuur en hoe muggen met deze parasieten kunnen worden geïnfecteerd met behulp van glazen membraanvoeders.

Introduction

Malaria wordt veroorzaakt door Plasmodium-parasieten en wordt overgedragen op hun gewervelde gastheren via infectieuze beet van vrouwelijke Anopheles-muggen. Volgens het rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) van 2019 waren er naar schatting 405.000 sterfgevallen, op een totaal van 228 miljoen gevallen van malaria¹. De meeste malariagerelateerde sterfgevallen waren geconcentreerd in de Afrikaanse regio, vooral bij kinderen jonger dan vijf jaar. Hoewel de totale incidentie van malaria vanaf 2010 wereldwijd is afgenomen, is de daling de afgelopen jaren gestabiliseerd en zijn aanvullende controlestrategieën dringend nodig om de ziekte te elimineren.

Cyclische aseksuele bloedstadia van malariaparasieten veroorzaken ziektepathogenese en een kleine subset hiervan onderscheidt zich in vrouwelijke en mannelijke gametocyten. Plasmodium falciparum gametocyten zijn uniek van aard omdat ze 7-10 dagen nodig hebben om zich te ontwikkelen door vijf morfologisch verschillende stadia. Onrijpe gametocyten van stadium I tot IV worden gesekwestreerd in beenmergparenchym en blijven grotendeels afwezig in de perifere^{circulatie 2,3,4,5}. Erytrocyten die zijn geïnfecteerd met volwassen stadium V-gametocyten komen vrij in de bloedbaan en circuleren vrij om door muggen te worden opgenomen. Eenmaal in het midgut van de mug worden gametocyten geactiveerd, door een verandering in temperatuur en blootstelling aan de midgut-omgeving, transformeren in vrouwelijke en mannelijke gameten en beginnen met de ontwikkeling van de muggenstadia, die culmineren in de infectieuze stadia van sporozoïeten in de speekselklieren van de mug^6,7.

Sinds Trager en Jenson⁸ een gestandaardiseerde methode beschreven om P. falciparumte culmineren, zijn studies over de aseksuele bloedstadia sterk gevorderd. Het ontbreken van een betrouwbaar kweeksysteem voor seksuele stadia heeft het echter moeilijk gemaakt om P. falciparum-gametocyten, transmissiebiologie en muggenstadia te bestuderen. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden gepubliceerd die laboratoria hebben geholpen bij het vaststellen van gametocytenculturen^9,10,11,12. Dit manuscript beschrijft een gestandaardiseerd en betrouwbaar protocol voor het cultureren van P. falciparum-gametocyten die een waardevolle bron kunnen vormen voor de malaria-onderzoeksgemeenschap. Deze methode maakt de robuuste productie van volwassen en infectieuze gametocyten mogelijk, wat samen met een gestandaardiseerd muggenvoedingsprotocol resulteert in een zeer betrouwbare muggeninfectie. Deze methoden werden vastgesteld om ononderbroken toevoer van gametocyten en parasieten in het muggenstadium te behouden. In dit manuscript beschrijven we een grondig gametocytencultuurprotocol (figuur 1), voorbereiding van glasmembraanvoeders en infectie van muggen met behulp van deze membraanvoeders (figuur 2), dissectie van midgut (figuur 3) en speekselklier van muggen (figuur 4) en kwantificering van infectie bij muggen na midgut en speekselklierdissectie.

Protocol

Bloedafnames die hieronder worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Johns Hopkins University. P. falciparum wordt gekweekt in verse RBC’s onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) faciliteit en voorzichtigheid is geboden bij het omgaan met biologische materialen. Na elke stap met bloed of bloedproducten wordt elk plasticgoed of glaswerk gespoeld met 10% bleekmiddel in de kap voordat het op de juiste manier wordt verwijderd. 1…

Representative Results

Hier presenteren we resultaten van een reeks membraanvoeders met behulp van P. falciparum NF54-gametocytenculturen gegenereerd met behulp van het bovenstaande protocol (zie (Figuur 5). De gametocytencultuur werd geïnitieerd met ongeveer 0,5% aseksuele cultuur in gemengd stadium op dag 0, die op dag 4 en dag 5 uitgroeide tot een piekparasiet van ongeveer 15%. Zoals te zien is in figuur 5A bij deze hoge parasietmie, worden de parasieten gestrest en crash…

Discussion

De hier beschreven methoden worden al meer dan 10 jaar met succes gebruikt bij het Johns Hopkins Malaria Research Institute^{15,16,17,18,19,20,21,22.} Gametocyten geproduceerd met behulp van dit protocol zijn gebruikt voor gametocytocidale assays met hoge door…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media