다양한 소 뇌 구조에서 광견병 바이러스의 양
Summary
이 프로토콜은 체외 전사를 사용하여 다양한 소 뇌 해부학 구조 내에서 광견병 바이러스 뉴클레오프로틴(N) 유전자 복사 수를 결정하기 위한 qRT-PCR 기반 접근법을 제시한다.
Abstract
소 마비 광견병 (BPR)은 라틴 아메리카 전역에 걸쳐 상당한 경제적 중요성의 바이러스 성 뇌염의 한 형태이며, 주요 동물 노 면 위험을 제기 합니다. 여기서, 우리의 목적은 정량적 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 이용하여 상이한 소 뇌 해부학 구조에서 광견병 바이러스(RABV) 게놈의 상대적 카피 수를 결정하는 실험실 프로토콜을 활용하는 것이었다. qRT-PCR은 시료에 존재하는 표적 핵산의 양에 직접적으로 비례하는 증폭 후 방출되는 형광에 기초하여 샘플에 존재하는 유전자 사본의 특정 수를 정량화한다. 이 방법은 짧은 기간, 오염 의 위험을 감소, 다른 기술에 비해 다른 샘플에서 바이러스 성 핵산을 검출 할 수있는 잠재력으로 인해 유리하다. 여섯 마리의 동물들의 뇌는 암몬의 뿔, 소뇌, 피질, 수질, 폰, 시상 등 여섯 가지 해부학적 구조로 나뉘었다. 모든 뇌는 직접적인 면역 형광 시험에 근거를 둔 RABV 항원에 대한 양성으로 확인되었습니다. 4개의 RABV 음성 소의 두뇌에서 동일 해부학 구조물도 평가되었습니다. RNA는 각 구조에서 추출되어 qRT-PCR에 사용되었습니다. 시험관 내 전사 뉴클레오단백질 유전자를 이용하여 RABV 유전자의 카피 수를 결정하기 위해 분석이 수행되었다. 바이러스 RNA를 정량화하는 데 사용되는 표준 곡선은 100% 및 0.99의 선형성을 나타냈다. 분석 결과, 피질, 수질 및 시상은 이러한 구조가 RABV의 최고 수준을 소유했다는 관측에 기초하여 RABV 검출에 사용하기에 이상적인 CNS 부분이었다는 것을 밝혔다. 시험 특이성은 100%였습니다. 모든 샘플은 긍정적이었고 거짓 긍정이 발견되지 않았습니다. 이 방법은 BPR의 진단 도중 RABV의 낮은 수준을 포함하는 견본에서 RABV를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
광견병은 뇌, 피부, 소변 또는 타액1에서바이러스 성 핵산의 검출을 가능하게 하는 다양한 기술에 의해 선행 및 사후 평가를 확인할 수 있다. 광견병 바이러스 뉴클레오단백질(N) 유전자의 검출은 주로 분자 시험에 의한 광견병 진단에 사용된다. 이 유전자는 또한 바이러스성 유전자 를 위해 이용됩니다. 광견병은 영향을받는 뇌의 어떤 부분을 사용하여 동물에서 진단 할 수 있습니다; 그러나 광견병의 가능성을 배제하려면 뇌의 적어도 두 부위에서 조직을 테스트해야합니다2. 동물에서 광견병 검출을 위한 몇몇 진단 방법은 존재합니다; 그러나, 직접적인 면역형광시험은 표준 기준기술3로남아 있다. 그밖 시험은 마우스 접종을 통합하는 생물학 시험을, 조직 배양에 있는 감염 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)4를포함합니다. 이러한 모든 기술은 인간과 동물의 광견병 진단을 위해 세계 보건 기구 (WHO)와 세계 동물 건강기구 (OIE)에 의해 각각 5권장됩니다.
핵산 검출 및 증폭 기술은 최근6년 동안 광견병의 진단에 혁명을 일으켰으며 이러한 기술은 인간 광견병의 절제 진단에 중요한 역할을 합니다. 몇몇 PCR 기지를 둔 시험은 앤테모템 및 사후 광견병에 대한 종래의 시험을 보완하기 위하여 평가되었습니다7,8,9,10. 대부분의 분석은 바이러스 게놈1,11에서가장 높은 보존 영역인 증폭을위한 바이러스 성 뉴클레오단백질 유전자를 표적으로 한다. 지난 20 년 동안, 다양한 분자 적 술RABV를 진단하기 위해 개발되었으며, 이러한 소의 일부는 바이러스 특성화에 사용되었습니다. 대부분의 예심은 바이러스 게놈 내의 보존된 유전자를 검출하는 것을 목표로, 가장 일반적으로 종래 또는 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)분석12,13을사용하여.
PCR은 조직 내의 주어진 병원체의 게놈을 검출할 수 있는 매우 민감한 진단 기술입니다, 이 조직이 분해되는 경우에. PCR 기반 접근법을 사용하여, DNA 뉴클레오티드서열(14)의선택적이고 반복적인 증폭을 통해 임상 샘플에서 최소한의 수량을 검출할 수 있다. 형광 프로브(예를 들어, TaqMan) 또는 DNA 결합 염료(예를 들어, SYBR Green)를 통합하는 qRT-PCR은 RABV를 모두 진단하는시험에서 사용되어 왔으며, 포스트– 높은 민감도를 가진 모템; 그러나 이러한 접근 방식에는 특수 장비가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 역전사 루프-중재이체형 증폭(RT-LAMP)은 RABV 검출을 위한 저비용, 단순성 및 바람직한 특성에 기초하여 제안되었다. 이 분석은 개발도상국15에서사용할 수 있기 때문에 특히 중요합니다.
qRT-PCR은 형광 신호 증가가 단일 반응에서 PCR 제품의 양에 직접 비례하는 분자의 검출 및 정량화를 기반으로 합니다. 핵산 표적의 사본 수가 증가함에 따라 형광도 증가합니다. SYBR 그린 DNA 결합 염료 또는 형광과 담소를 운반하는 서열 별 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 비특이적 상호 작용 염료는 일반적으로 qRT-PCR에서 형광 판독을 제공하는 데 사용된다. 이 분석은 더 짧은 시험 시간 (2-4 시간), 폐쇄 튜브 시스템 (증폭 된 제품의 후 PCR 조작부족)으로 인한 오염 위험 감소, 동시에 다른 표적을 감지 할 수있는 능력을 포함하는 기존의 RT-PCR에 비해 이점을 제공한다16. qRT-PCR은 타액 및 기타 샘플에서 광견병 앤테모템을 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 또한 RABV15의다른 리사바이러스 종 또는 혈통의 검출을 위한 보편적인 실시간 시험으로 사용될 수 있다. 이 콤보 RT-PCR 접근 방식에서는 두 가지 반응이 사용됩니다. 첫 번째는 RABV의 다른 유전 보종을 검출하고, 두 번째는 Lyssavirus 종을 검출합니다. 두 단계 모두 qRT-PCR assays를 포함하며, 첫 번째 는 혼성화 프로브를 사용하고 두 번째 단계는 염료15를사용합니다. 이 기술을 사용하여 RABV의 성공적인 분자 검출을 입증한 많은 수의 테스트로 인해 현재 OIE 지상매뉴얼(2018)은 RABV17의분자 검출을 위해 PCR을 사용하는 것이 좋습니다.
멕시코는 상당한 가축 잠재력을 가진 나라입니다. 가축 생산량이 가장 높은 주에는 광견병의 주요 송신기인 뱀파이어 박쥐 데스모두스 로툰더스의 존재로 인해 광견병 발병 위험이 있는 습한 열대 지역과 건조한 지역이 모두 포함되어 있습니다. 따라서 멕시코의 소 마비 광견병 (BPR)을 예방하고 제어하기위한 더 많은 도구를 개발하는 것이 필수적입니다. 이를 바탕으로, 이 연구의 목적은 광견병 감염으로 인한 사망 후 소 뇌의 다른 해부학 적 구조에서 바이러스 성 입자의 수를 결정하기 위해 정량적 qRT-PCR을 사용하는 것이었습니다.
RABV 양성 소에서 얻은 6개의 두뇌는 아래에 기술된 qRT-PCR 프로토콜의 개발에 사용하기 위해 외부 실험실에 의해 기증되었습니다. 소 뇌 구조 샘플은 INIFAP CENID-MA 실험실 BSL-2 시설로 이송된 콜드 체인을 사용전까지 -80°C에 저장하였다. 뇌는 캄페체, 유카탄, 케레타로 주에서 동물로부터 얻어졌다. 영수증 전에, 다양한 구조는 뇌에서 해부되었다. 이러한 구조에는 암몬의 뿔, 소뇌, 피질, 수질, 폰, 시상18,19가포함되었다. 유전 물질은 아래에 설명된 바와 같이 추출되었다. RABV 진단은 직접 형광 항체(DFA)(20)를사용하여 확인되었다. 긍정적 인 대조군으로, RABV21로 접종 된 마우스 뇌가 사용되었습니다. 또한, 4 개의 RABV 음성 가축 두뇌 (DFA에 의해 결정) 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구는 DFA가 실온 (21 °C)14에서저장되는 샘플의 7 일 이내에 RABV를 감지 할 수 있음을 보여 주었다. 대조적으로, 이 연구는 견본이 12 일 동안 실온에 드러낸 후에 RT-PCR의 감도가 감소하기 시작한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 RABV 게놈은 최대 23일 동안 실온에 노출된 샘플에서 qRT-PCR에 의해 검출될 수 있다. 이는 qRT-PCR의 감도가 더 높게 분해된 시료에 대해 상대적으로 높?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 농업, 임업 및 가축 연구 (INIFAP)에 의해 지원되었다. 이 문서와 관련된 비디오 개발에 대한 그의 협력에 대한 Jerzayn Fraustro Esquivel에 감사드립니다.
Materials
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
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