Kvantsetting av rabiesvirus i ulike bovine hjernestrukturer

Summary

Denne protokollen presenterer en qRT-PCR-basert tilnærming for å bestemme rabiesvirus nukleoprotein (N) genkopinummer i ulike bovin hjerneanatomiske strukturer ved hjelp av in vitro transkripsjon.

Abstract

Bovine paralytiske rabies (BPR) er en form for viral encefalitt som er av betydelig økonomisk betydning i hele Latin-Amerika, hvor det utgjør en stor zoonotisk risiko. Her var vårt mål å bruke en laboratorieprotokoll for å bestemme det relative kopinummeret til rabiesviruset (RABV) genomet i forskjellige bovine hjerneanatomiske strukturer ved hjelp av kvantitativ sanntids omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR). qRT-PCR kvantifiserer det spesifikke antallet genkopier som finnes i en prøve basert på fluorescens som slippes ut etter forsterkning som er direkte proporsjonal med mengden målkjernesyre som finnes i prøven. Denne metoden er fordelaktig på grunn av sin korte varighet, redusert risiko for forurensning og potensial for å oppdage virale nukleinsyrer i forskjellige prøver lettere sammenlignet med andre teknikker. Hjernen til seks rabiate dyr ble delt inn i seks anatomiske strukturer, nemlig Ammons horn, cerebellum, cortex, medulla, pons og thalamus. Alle hjerner ble identifisert som positive for RABV-antigener basert på en direkte immunfluorescenstest. De samme anatomiske strukturene fra hjernen til fire RABV-negative storfe ble også vurdert. RNA ble hentet fra hver struktur og brukt til qRT-PCR. En analyse ble utført for å bestemme kopitallene til RABV-gener ved hjelp av et in vitro transkribert nukleoproteingen. Standardkurven som brukes til å kvantifisere viral RNA viste en effektivitet på 100% og linearitet på 0,99. Analyse viste at cortex, medulla og thalamus var de ideelle CNS-delene for bruk i RABV-deteksjon, basert på observasjonen om at disse strukturene hadde de høyeste nivåene av RABV. Test spesifisiteten var 100%. Alle prøver var positive, ingen falske positiver ble oppdaget. Denne metoden kan brukes til å oppdage RABV i prøver som inneholder lave nivåer av RABV under diagnostisering av BPR.

Introduction

Rabies kan bekreftes ante-mortem og post-mortem ved ulike teknikker som muliggjør påvisning av virale nukleinsyrer i hjernen, huden, urinen eller spytt¹. Påvisning av rabiesviruskjerneprotein (N) genet brukes primært til rabiesdiagnose ved molekylære tester. Dette genet brukes også til viral genotyping. Rabies kan diagnostiseres hos dyr ved hjelp av en hvilken som helst del av den berørte hjernen; For å utelukke muligheten for rabies, må vev fra minst to regioner i hjernen imidlertid testes². Det finnes flere diagnostiske metoder for rabiesdeteksjon hos dyr; Den direkte immunfluorescenstesten forblir imidlertid standard referanseteknikk³. Andre tester inkluderer biologiske tester som inkorporerer musinokulering, infeksjon i vevskultur og polymerasekjedereaksjon (PCR)⁴. Alle disse teknikkene anbefales av Verdens helseorganisasjon (WHO) og World Organization of Animal Health (OIE) for diagnostisering av rabies hos mennesker og dyr, henholdsvis⁵.

Nukleinsyredeteksjon og forsterkningsteknikker har revolusjonert diagnosen rabies de siste årene^6, og disse teknikkene spiller en viktig rolle i ante mortem-diagnosen av menneskelige rabies. Flere PCR-baserte tester har blitt evaluert for å utfylle konvensjonelle tester for ante-mortem og post-mortem rabies diagnoser^7,8,9,10. De fleste analyser retter seg mot rabies viral nukleoprotein gen for forsterkning som er den mest bevarte regionen i viral genom^1,11. I løpet av de siste 20 årene har ulike molekylære analyser blitt utviklet for å diagnostisere RABV, og noen av disse analysene har blitt brukt til viruskarakterisering. De fleste studier har som mål å oppdage konserverte gener i det virale genomet, oftest ved å bruke konvensjonelle eller kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) analyser^12,13.

PCR er en svært følsom diagnostisk teknikk som kan oppdage genomet til et gitt patogen i vev, selv når disse vevene brytes ned. Ved hjelp av PCR-baserte tilnærminger kan minimale mengder av et smittsomt middel påvises i en klinisk prøve gjennom selektiv og repeterende forsterkning av en DNA-nukleotidsekvens¹⁴. qRT-PCR som inkorporerer fluorescerende sonder (f.eks. TaqMan) eller DNA-bindende fargestoffer (f.eks. SYBR Green) har blitt brukt i studier for å diagnostisere RABV både ante– og post– mortem med høy følsomhet; En slik tilnærming krever imidlertid spesialisert utstyr. For å overvinne denne begrensningen har omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP) blitt foreslått, basert på lave kostnader, enkelhet og ønskelige egenskaper for påvisning av RABV. Denne analysen er spesielt viktig, da den kan brukes i utviklingsland¹⁵.

qRT-PCR er basert på deteksjon og kvantifisering av et molekyl, hvor fluorescerende signaløkninger er i direkte forhold til mengden PCR-produkt i en enkelt reaksjon. Etter hvert som antall kopier av nukleinsyremålet øker, øker også fluorescensen. Ikke-spesifikke interkalerende fargestoffer som SYBR Grønn DNA-bindende fargestoff eller sekvensspesifikke oligonukleotidprober som bærer fluorofor og en quencher brukes ofte til å gi fluorescerende avlesning i qRT-PCR. Denne analysen gir fordeler i forhold til konvensjonell RT-PCR som inkluderer kortere testtid (2-4 t), redusert risiko for forurensning på grunn av det lukkede rørsystemet (mangel på post-PCR-manipulering av forsterkede produkter), og evnen til å oppdage forskjellige mål samtidig¹⁶. qRT-PCR kan brukes til å diagnostisere rabies ante-mortem fra spytt og andre prøver. Denne analysen kan også brukes som en universell sanntidstest for påvisning av forskjellige Lyssavirus-arter eller avledninger av RABV¹⁵. I denne kombinasjonen RT-PCR tilnærming brukes to reaksjoner. Den første oppdager forskjellige genetiske linasjer av RABV, og den andre oppdager Lyssavirus-arten. Begge trinnene involverer qRT-PCR-analyser, der den første bruker hybridiseringssonder og den andre bruker fargestoffer¹⁵. På grunn av det store antallet tester som har vist vellykket molekylær deteksjon av RABV ved hjelp av denne teknikken, anbefaler den nåværende OIE Terrestrial Manual (2018) bruk av PCR for molekylær deteksjon av RABV¹⁷.

Mexico er et land med betydelig husdyrpotensial. Statene med høyest husdyrproduksjon inneholder både fuktige tropiske regioner og tørre områder som er i fare for rabiesutbrudd på grunn av tilstedeværelsen av vampyrflaggermusen Desmodus rotundus, den viktigste senderen av rabies. Derfor er det viktig å utvikle flere verktøy for forebygging og kontroll av storfe paralytiske rabies (BPR) i México. Basert på dette var målet med denne studien å bruke kvantitativ qRT-PCR for å bestemme antall virale partikler i forskjellige anatomiske strukturer av storfehjerner etter døden på grunn av rabiesinfeksjon.

Seks hjerner hentet fra RABV-positive storfe ble donert av et eksternt laboratorium for bruk i utviklingen av qRT-PCR-protokollen beskrevet nedenfor. De bovine hjernestrukturprøvene ble kaldkjedet transportert til INIFAP CENID-MA-laboratoriet BSL-2-anlegget og lagret ved -80 °C til bruk. Hjerner ble hentet fra dyr fra delstatene Campeche, Yucatán og Querétaro. Før kvitteringen ble ulike strukturer dissekert fra hjernen. Disse strukturene inkluderte Ammons horn, cerebellum, cortex, medulla, pons og thalamus^18,19. Genetisk materiale ble ekstrahert som beskrevet nedenfor. RABV diagnose ble bekreftet ved hjelp av direkte fluorescerende antistoffer (DFA)²⁰. Som en positiv kontroll ble musehjerner som ble inokulert med RABV²¹ brukt. I tillegg ble fire RABV-negative storfehjerner (som bestemt av DFA) brukt som negative kontroller.

Protocol

Denne studien ble godkjent av og utført i henhold til anbefalingene for bruk av dyr levert av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA). 1. Prøver Bruk forskjellige områder av hjernen dissekert fra 6 forskjellige rabies-positive storfehjerner for RT-PCR-analyse. 2. Direkte fluorescerende antistoffer (DFAer) for å bekrefte rabies <p class="jove_conten…

Representative Results

DFA-resultatene viste henholdsvis 100%, 100%, 83,3%, 66% og 50% positivitet for RABV i cortex, thalamus, medulla, pons og horn. Disse resultatene bekreftet de tidligere resultatene, og minst tre av strukturene dissekert fra hver hjerne var positive for RABV. En representativ positiv DAF-farging er vist i figur 1. Figur 2 viser forsterkning av et fragment av RABV N-genet (trinn 5.5) med primerne først rapportert av Loza-Rubio et al.<s…

Discussion

Tidligere studier har vist at DFA bare kan oppdage RABV innen syv dager etter at prøven er lagret ved romtemperatur (21 °C)¹⁴. Derimot viste dette arbeidet at følsomheten til RT-PCR begynner å avta etter at prøvene har blitt utsatt for romtemperatur i 12 dager. Derfor kan RABV-genomet påvises av qRT-PCR i prøver utsatt for romtemperatur i opptil 23 dager. Dette viser at følsomheten til qRT-PCR er relativt høyere for mer nedbrutte prøver. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å utvikle e…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.