Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Summary

Este protocolo apresenta uma abordagem baseada em qRT-PCR para determinar o número de cópia genética do vírus da raiva (N) dentro de várias estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando transcrição in vitro.

Abstract

A raiva paralítica bovina (BPR) é uma forma de encefalite viral que é de importância econômica substancial em toda a América Latina, onde representa um grande risco zoonótico. Aqui, nosso objetivo era utilizar um protocolo laboratorial para determinar o número de cópia relativa do genoma do vírus da raiva (RABV) em diferentes estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando reação quantitativa em cadeia de transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica o número específico de cópias genéticas presentes em uma amostra baseada na fluorescência emitida após a amplificação que é diretamente proporcional à quantidade de ácido nucleico alvo presente na amostra. Este método é vantajoso devido à sua curta duração, risco reduzido de contaminação e potencial para detectar ácidos nucleicos virais em diferentes amostras mais facilmente em comparação com outras técnicas. Os cérebros de seis animais raivosos foram divididos em seis estruturas anatômicas, ou seja, o chifre de Ammon, cerebelo, córtex, medula, pons e tálamo. Todos os cérebros foram identificados como positivos para antígenos RABV com base em um teste de imunofluorescência direta. As mesmas estruturas anatômicas do cérebro de quatro bovinos RABV negativos também foram avaliadas. O RNA foi extraído de cada estrutura e utilizado para qRT-PCR. Um ensaio foi realizado para determinar o número de cópias dos genes RABV usando um gene de nucleoproteína transcrito in vitro. A curva padrão utilizada para quantificar o RNA viral apresentou uma eficiência de 100% e linearidade de 0,99. A análise revelou que o córtex, medula e tálamo foram as porções ideais de CNS para uso na detecção de RABV, com base na observação de que essas estruturas possuíam os mais altos níveis de RABV. A especificidade do teste foi de 100%. Todas as amostras foram positivas, não foram detectados falsos positivos. Este método pode ser usado para detectar RABV em amostras que contenham baixos níveis de RABV durante o diagnóstico de BPR.

Introduction

A raiva pode ser confirmada antes-mortem e post-mortem por várias técnicas que permitem a detecção de ácidos nucleicos virais no cérebro, pele, urina ou saliva¹. A detecção do gene nucleoproteína do vírus da raiva (N)é usada principalmente para o diagnóstico de raiva por testes moleculares. Este gene também é usado para genotipagem viral. A raiva pode ser diagnosticada em animais usando qualquer porção do cérebro afetado; no entanto, para excluir a possibilidade de raiva, tecidos de pelo menos duas regiões do cérebro devem ser testados². Existem vários métodos de diagnóstico para detecção de raiva em animais; no entanto, o teste de imunofluorescência direta continua sendo a técnica de referência padrão³. Outros testes incluem testes biológicos que incorporam a inoculação do camundongo, infecção na cultura tecidual e reação em cadeia de polimerase (PCR)⁴. Todas essas técnicas são recomendadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e Pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o diagnóstico de raiva em humanos e animais,^{respectivamente 5}.

Técnicas de detecção e amplificação de ácido nucleico revolucionaram o diagnóstico da raiva nos últimos^{anos 6} e essas técnicas desempenham um papel importante no diagnóstico ante mortem da raiva humana. Vários testes baseados em PCR foram avaliados para complementar os testes convencionais para diagnósticos de raiva pré-mortem e pós-morte ^7,8,9,10. A maioria dos ensaios tem como alvo o gene de nucleoproteína viral da raiva para amplificação, que é a região mais conservada do genoma viral^1,11. Nos últimos 20 anos, vários ensaios moleculares foram desenvolvidos para diagnosticar o RABV, e alguns desses ensaios têm sido usados para caracterização de vírus. A maioria dos ensaios tem como objetivo detectar genes conservados dentro do genoma viral, mais comumente usando ensaios de corrente de polimerase convencional ou quantitativo (qRT-PCR)^12,13.

PcR é uma técnica de diagnóstico altamente sensível que pode detectar o genoma de um dado patógeno dentro dos tecidos, mesmo quando esses tecidos estão decompostos. Utilizando abordagens baseadas em PCR, quantidades mínimas de um agente infeccioso podem ser detectadas em uma amostra clínica através da amplificação seletiva e repetitiva de uma sequência de nucleotídeos de DNA¹⁴. qRT-PCR que incorpora sondas fluorescentes (por exemplo, TaqMan) ou corantes de vinculação de DNA (por exemplo, SYBR Green) tem sido usado em ensaios para diagnosticar RABV tanto ante– quanto post– mortem com alta sensibilidade; no entanto, tal abordagem requer equipamentos especializados. Para superar essa limitação, foi sugerido amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP), com base em seu baixo custo, simplicidade e características desejáveis para a detecção de RABV. Este ensaio é particularmente importante, pois pode ser utilizado em países em desenvolvimento¹⁵.

qRT-PCR baseia-se na detecção e quantificação de uma molécula, onde os aumentos de sinal fluorescente são em proporção direta à quantidade de produto PCR em uma única reação. À medida que o número de cópias do alvo do ácido nucleico aumenta, a fluorescência também aumenta. Corantes intercalantes não específicos, como o corante de dna verde SYBR ou sondas de oligonucleotídeos específicas da sequência que carregam um fluoróforo e um quencher são comumente usados para fornecer a leitura fluorescente em qRT-PCR. Este ensaio oferece vantagens sobre o RT-PCR convencional que incluem um tempo de teste mais curto (2-4 h), risco reduzido de contaminação devido ao sistema de tubo fechado (falta de manipulação pós-PCR de produtos amplificados) e a capacidade de detectar diferentes alvos simultaneamente¹⁶. qRT-PCR pode ser usado para diagnosticar raiva ante-mortem da saliva e outras amostras. Este ensaio também pode ser usado como um teste universal em tempo real para a detecção de diferentes espécies de Lyssavirus ou linhagens de RABV¹⁵. Nesta abordagem combo RT-PCR, duas reações são usadas. O primeiro detecta diferentes linagens genéticas de RABV, e o segundo detecta a espécie Lyssavirus. Ambas as etapas envolvem ensaios qRT-PCR, onde o primeiro usa sondas de hibridização e o segundo usa corantes¹⁵. Devido ao grande número de testes que demonstraram sucesso na detecção molecular do RABV utilizando essa técnica, o atual Manual Terrestre OIE (2018) recomenda o uso de PCR para a detecção molecular de RABV¹⁷.

O México é um país com considerável potencial pecuário. Os estados com maior produção pecuária contêm regiões tropicais úmidas e regiões secas que estão em risco de surtos de raiva devido à presença do morcego vampiro Desmodus rotundus, o principal transmissor da raiva. Por isso, é essencial desenvolver mais ferramentas para a prevenção e controle da raiva paralímtica bovina (BPR) no México. Com base nisso, o objetivo deste estudo foi utilizar o qRT-PCR quantitativo para determinar o número de partículas virais em diferentes estruturas anatômicas de cérebros bovinos após a morte por infecção por raiva.

Seis cérebros obtidos de bovinos soropositivos de RABV foram doados por um laboratório externo para uso no desenvolvimento do protocolo qRT-PCR descrito abaixo. As amostras da estrutura cerebral bovina foram transportadas para a instalação do laboratório BSL-2 do laboratório INIFAP CENID-MA e armazenadas a -80 °C até o uso. Cérebros foram obtidos de animais dos estados de Campeche, Yucatán e Querétaro. Antes do recebimento, várias estruturas foram dissecadas do cérebro. Essas estruturas incluíam o chifre de Ammon, cerebelo, córtex, medula, pons e tálamo^18,19. O material genético foi extraído como descrito abaixo. O diagnóstico de RABV foi confirmado utilizando anticorpos fluorescentes diretos (DFA)²⁰. Como controle positivo, foram utilizados cérebros de camundongos que foram inoculados com RABV^21. Além disso, quatro cérebros de bovinos RABV negativos (determinados pela DFA) foram utilizados como controles negativos.

Protocol

Este estudo foi aprovado e conduzido de acordo com as recomendações de uso de animais fornecidos pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) do Centro Nacional de Investigação Disciplinar en Microbiología Animal (CENID-MA). 1. Amostras Use diferentes áreas do cérebro dissecadas de 6 diferentes cérebros bovinos antirrábicos positivos para análise de RT-PCR. 2. Anticorpos fluorescentes diretos (DFAs) para confirmar raiva</p…

Representative Results

Os resultados do DFA mostraram 100%, 100%, 83,3%, 66% e 50% de positividade para RABV no córtex, tálamo, medula, pons e chifre, respectivamente. Esses resultados confirmaram os resultados anteriores, e pelo menos três das estruturas dissecadas de cada cérebro foram positivas para o RABV. Uma coloração da DAF positiva representativa é mostrada na Figura 1. A Figura 2 mostra a amplificação de um fragmento do gene RABV N (passo …

Discussion

Estudos anteriores mostraram que a DFA só pode detectar RABV dentro de sete dias após a amostra ser armazenada à temperatura ambiente (21 °C)¹⁴. Em contrapartida, este trabalho demonstrou que a sensibilidade do RT-PCR começa a diminuir depois que as amostras foram expostas à temperatura ambiente por 12 dias. Portanto, o genoma RABV pode ser detectado por qRT-PCR em amostras expostas à temperatura ambiente por até 23 dias. Isso demonstra que a sensibilidade do qRT-PCR é relativamente maior…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.