チラリア性神経節ニューロンの分離と培養
Summary
ひよこ毛様体神経節(CG)は副交感神経系の一部である。ひよこCGニューロンの神経細胞培養は、神経筋相互作用の研究において有効な細胞モデルであることが示された。我々は、ひよこ胚からのCGニューロンの解剖、解離およびインビトロ培養のための詳細なプロトコルを記述する。
Abstract
ひよこ毛様体神経節(CG)は副交感神経系の一部であり、眼に存在する筋肉組織の神経の活性化を担当する。この神経節は、それぞれ、内臓が線状筋線維と平滑筋線維を線状にした毛様体及び脈絡膜ニューロンの均質集団によって構成される。これらの神経細胞タイプのそれぞれは、特定の眼の構造と機能を調節します。長年にわたり、ひよこ毛様体神経節の神経細胞培養は、コリン作動性シナプスを介して通信する筋肉神経系相互作用の研究において有効な細胞モデルであることが示された。毛様神経節ニューロンは、その大部分で、コリン作動性である。この細胞モデルは、コリン作動性以外にも、いくつかの神経細胞型を含む、以前に使用されていた異種細胞モデルに比較的有用であることが示されている。解剖学的に、毛様体神経節は視神経(ON)と脈絡膜裂動(CF)の間に局在する。ここでは、ひよこ胚由来の毛様神経節ニューロンの解剖、解離および体外培養の詳細な手順を説明する。CGニューロンの非常に純粋で安定した細胞培養を得るためにステップバイステップのプロトコルを提供し、プロセスの重要なステップを強調しています。これらの培養は15日間インビトロで維持することができ、この結果、CG培養の正常な発展を示す。結果はまた、これらのニューロンが神経筋コリン作動性シナプスを介して筋線維と相互作用できることを示す。
Introduction
毛様神経節(CG)ニューロンは副交感神経系に属する。これらのニューロンはコリン作動性であり、ムスカリン性またはニコチン性シナプス11、2、32,3を確立することができる。解剖学的には、CGは視神経(ON)と脈絡膜裂け(CF)との間の眼の後部に位置し、初期胚期11、44の約6000ニューロンからなる。培養の最初の1週間、毛様神経節ニューロンは多極形態を提示する。1週間後、彼らは単極状態に移行し始め、1つの神経突起が延長され、軸索5を形成する。さらに、CGニューロンの約半数は、細胞死のプログラムプロセスを通じて、ひよこ胚の発達の8日目から14日目の間に死ぬ。ニューロン数の減少は,、約3000ニューロン6、7、87の毛様体の総集団をもたらす。68インビトロでは、筋細胞9およびCGニューロンで増殖した場合のCGニューロンの数の減少がなく、数週間1、99のために培養することができる。1
毛様性神経節は、毛様体ニューロンと脈絡膜ニューロンの均質な集団で構成され、それぞれがCGのニューロン集団の半分を表し、眼の筋肉を内在化する。これらの2種類のニューロンは、構造上、解剖学的、機能的に異なっている。毛様体ニューロンは虹彩とレンズ上の線条性筋線維を内側に吐き出し、瞳孔収縮を担当する。脈絡膜ニューロンは、脈絡膜1、10、11、1210,11の平滑筋を内側に入れ、1
鶏毛様神経節ニューロンの培養は、神経筋シナプスおよびシナプス形成11、5、95,9の研究に有用なツールであることが示されている。神経筋シナプスがコリン作動性13であることを考えると、コリン作動性である神経集団を用いて – CGニューロン – 以前の細胞モデル14に代わる潜在的な代替として浮上した。これらのモデルは異種神経集団で構成され、ほんの一部だけがコリン作動性である。あるいは、毛様性神経節ニューロンは、インビトロで比較的速く発達し、約15時間後にすでにシナプス1を形成している。CGニューロンは、比較的容易な分離と操作のために、明確な研究のために長年にわたってモデルシステムとして使用されてきました。これらのアプリケーションには、光遺伝学的研究、シナプスの発達、アポトーシスおよび神経筋相互作用14,15,15が含まれる。
我々は、胚性7日目(E7)のひよこ胚からの毛様神経節ニューロンの解剖、解離およびインビトロ培養のための詳細な手順を説明する。我々は、コリン作動性ニューロンの非常に純粋で安定した細胞培養を得るために、ステップバイステップのプロトコルを提供する。我々はまた、特別な注意を必要とし、神経培養の質を向上させるプロトコルの重要なステップを強調する。これらの培養物は、少なくとも15日間インビトロで維持することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、CGニューロンの調製と培養の方法を示した。毛様体の同定と解剖は、経験の浅いユーザーにとって困難な場合があります。そこで、E7のひよこ毛様体神経節を効率的に解剖し、組織を解離し、少なくとも15日間維持できる神経細胞培養を調製するための詳細かつ段階的な手順を提示する。このプロトコルで得られた毛様神経節ニューロンは、筋肉細胞との共培養にも適し?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020、CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGEの下でCentro 2020地域運用プログラムを通じて、欧州地域開発基金(ERDF)によって資金提供されました。 CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS、およびCOMPETE 2020を通じて – FCTを介して競争力と国際化のための運用プログラムとポルトガルの国民資金 – フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア、I.P.、プロジェクトUIDB/04539/2020、 UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, 個人助成金 SFRH/BD/141092/20 18 (M.D.)、DL57/2016/CP1448/CT0009(R.O.C.)、SFRH/BD/2011(J.R.P.)、マリー・キュリー・アクションズ – IRG、第7回フレームワーク・プログラム。
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Biologie du développement. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
