Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons
Summary
As gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático. Culturas neuronais de neurônios CG foram mostrados como modelos celulares eficazes no estudo das interações musculares nervosas. Descrevemos um protocolo detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios CG de embriões de filhotes.
Abstract
Os gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático e são responsáveis pela inervação dos tecidos musculares presentes no olho. Este gânglio é constituído por uma população homogênea de neurônios ciliares e coroidais que invato fibras musculares e lisas, respectivamente. Cada um desses tipos neuronais regulam estruturas e funções oculares específicas. Ao longo dos anos, as culturas neuronais do gânglio ciliar filhote mostraram-se modelos celulares eficazes no estudo das interações músculo-nervoso do sistema, que se comunicam por meio de sinapses colinérgicas. Os neurônios ciliares são, em sua maioria, colinérgicos. Este modelo celular tem se mostrado útil comparativamente aos modelos celulares heterogêneos anteriormente utilizados que compreendem vários tipos neuronais, além da colinérgica. Anatomicamente, o gânglio ciliar é localizado entre o nervo óptico (ON) e a fissura choroide (CF). Aqui, descrevemos um procedimento detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios gânglios ciliares de embriões de filhotes. Fornecemos um protocolo passo-a-passo para obter culturas celulares altamente puras e estáveis dos neurônios CG, destacando as principais etapas do processo. Essas culturas podem ser mantidas in vitro por 15 dias e, por meio deste, mostramos o desenvolvimento normal das culturas cg. Os resultados também mostram que esses neurônios podem interagir com fibras musculares através de sinapses colinérgicas neuromusmas.
Introduction
Os neurônios de gânglio ciliar (CG) pertencem ao sistema nervoso parassimpático. Estes neurônios são colinérgicos, sendo capazes de estabelecer sinapses muscarínicos ou nicotínicas1,,2,3. Anatomicamente, o CG está localizado na parte posterior do olho entre o nervo óptico (ON) e a fissura coroóide (CF) e consiste em cerca de 6000 neurônios nos estágios embrionários iniciais1,,4. Para a primeira semana na cultura, os neurônios ciliares de gânglio apresentam uma morfologia multipolar. Após uma semana, eles começam a transição para um estado unipolar, com um neurite estendendo e formando o axônio5. Além disso, aproximadamente metade dos neurônios CG morrem entre os dias8 e 14th do desenvolvimento de embriões de filhotes, através de um processo programado de morte celular. Essa diminuição no número de neurônios resulta em uma população total do gânglio ciliar de cerca de 3000 neurônios6,7,8. In vitro, não há redução no número de neurônios CG quando cultivados com células musculares9 e neurônios CG podem ser cultivados por várias semanas1,9.
O gânglio ciliar consiste em uma população homogênea de neurônios ciliares e neurônios coroidais, cada um representando metade da população neuronal no CG, inervando o músculo do olho. Esses dois tipos de neurônios são estruturalmente, anatomicamente e funcionalmente distintos. Os neurônios ciliares inervam as fibras musculares estriadas na íris e na lente, sendo responsáveis pela contração da pupila. Os neurônios choroidais inervam o músculo liso do coroide1,10,11,12.
Culturas de neurônios gânglios ciliar de frango têm se mostrado ferramentas úteis para o estudo de sinapses neuromusculares e formação de sinapse1,,5,9. Considerando que as sinapses neuromusculares são colinérgicas13, utilizando uma população neuronal que é colinérgica – neurônios CG – emergiu como alternativa potencial aos modelos celulares anteriores14. Esses modelos consistiam em uma população neuronal heterogrógena, na qual apenas uma pequena parte é colinérgica. Alternativamente, os neurônios de gânglio ciliar desenvolvem-se in vitro relativamente rápido, e após aproximadamente 15 horas já formam sinapses1. Os neurônios CG têm sido usados como um sistema modelo ao longo dos anos para estudos de pesquisa distintos, devido à sua relativa facilidade de isolamento e manipulação. Essas aplicações incluem estudos optogenéticos, desenvolvimento de sinapse, apoptose e interações neuromusculares14,15.
Descrevemos um procedimento detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios gânglios ciliares a partir de embriões de filhotes embrionários do dia 7 (E7). Fornecemos um protocolo passo-a-passo para obter culturas celulares altamente puras e estáveis de neurônios colinérgicos. Destacamos também os principais passos do protocolo que requerem atenção especial e que melhorarão a qualidade das culturas neuronais. Essas culturas podem ser mantidas in vitro por pelo menos 15 dias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, demonstramos como preparar e cultivar neurônios CG. A identificação e dissecação do gânglio ciliar pode ser difícil para usuários não-experimentais. Por isso, apresentamos um procedimento detalhado e passo a passo para dissecar eficientemente o Gânglio ciliar do pintinho E7, dissociar o tecido e preparar culturas neuronais que podem ser mantidas por pelo menos 15 dias. Os neurônios gânglios ciliares obtidos com este protocolo também são adequados para a co-cultura com células musculares.</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF), por meio do Programa Operacional Regional centro 2020, sob os projetos CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, e através do COMPETE 2020 – Programa Operacional de Competitividade e Internacionalização e Fundos Nacionais Portugueses via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., sob os projetos UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, e as bolsas individuais SFRH/BD/141092/22018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) e por Marie Curie Actions – IRG, 7º Programa-Quadro.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
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