Isolering och kultur chick Ciliary Ganglion nervceller
Summary
Chick ciliary ganglier (CG) är en del av det parasympatiska nervsystemet. Neuronala kulturer av chick CG nervceller visade sig vara effektiva cellmodeller i studien av nervmuskelinteraktioner. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för dissekering, dissociation och in vitro kultur CG nervceller från chick embryon.
Abstract
Chick ciliary ganglierna (CG) är en del av det parasympatiska nervsystemet och är ansvariga för innervation av muskelvävnader som finns i ögat. Denna ganglion består av en homogen population av ciliary och koroidala nervceller som innervate tvärstrimmiga och glatta muskelfibrer, respektive. Var och en av dessa neuronala typer reglerar specifika ögonstrukturer och funktioner. Under årens lopp, neuronala kulturer av chick ciliary ganglier visade sig vara effektiva cellmodeller i studien av muskel-nervsystemet interaktioner, som kommunicerar genom kolinerga synapser. Ciliary ganglion nervceller är, i sin majoritet, kolinerga. Denna cell modell har visat sig vara användbar jämförelsevis till tidigare använda heterogena cellmodeller som omfattar flera neuronala typer, förutom kolinerga. Anatomiskt är ciliary ganglion lokaliserad mellan synnerven (ON) och choroid spricka (CF). Här beskriver vi ett detaljerat förfarande för dissekering, dissociation och in vitro kultur ciliary ganglier nervceller från chick embryon. Vi erbjuder ett steg-för-steg-protokoll för att få mycket rena och stabila cellulära kulturer av CG nervceller, belysa viktiga steg i processen. Dessa kulturer kan upprätthållas in vitro i 15 dagar och härmed visar vi den normala utvecklingen av CG kulturer. Resultaten visar också att dessa nervceller kan interagera med muskelfibrer genom neuro-muskulös kolinerga synapser.
Introduction
Ciliary ganglion (CG) nervceller tillhör det parasympatiska nervsystemet. Dessa nervceller är kolinerga, att kunna etablera muscarinic eller nikotin synapser1,2,3. Anatomiskt är CG ligger i den bakre delen av ögat mellan synnerven (ON) och choroid spricka (CF) och består av cirka 6000 nervceller i tidiga embryonala stadier1,4. För den första veckan i kultur, ciliary ganglion nervceller presentera en multipolär morfologi. Efter en vecka börjar de övergå till ett unipolärt tillstånd, med en neurit som sträcker sig och bildar axon5. Dessutom dör ungefär hälften av CG nervceller mellan den8: e och 14:e dagen av chick embryo utveckling, genom en programmerad process av celldöd. Denna minskning av antalet nervceller resulterar i en total population av ciliary ganglion av cirka 3000 nervceller6,7,8. In vitro, Det finns ingen minskning av antalet CG nervceller när odlas med muskelceller9 och CG nervceller kan odlas i flera veckor1,9.
Ciliary ganglion består av en homogen population av ciliary nervceller och koroidala nervceller, var och en representerar hälften av neuronala befolkningen i CG, innervating muskeln i ögat. Dessa två typer av nervceller är strukturellt, anatomiskt och funktionellt distinkta. Ciliary nervceller innervate tvärstrimmiga muskelfibrer på iris och lins, är ansvarig för elevkontraktion. Choroidal nervceller innervate glatt muskulatur choroid1,10,,11,12.
Kulturer av kyckling ciliary ganglion nervceller har visat sig vara användbara verktyg för studier av neuromuskulära synapser och synaps bildning1,5,9. Med tanke på att neuromuskulära synapser är kolinerga13, med hjälp av en neuronal population som är kolinerga – CG nervceller – framstod som ett potentiellt alternativ till tidigare cellmodeller14. Dessa modeller bestod i en heterogen neuronal population, där endast en liten del är kolinerga. Alternativt, ciliary ganglion nervceller utveckla relativt snabb in vitro, och efter cirka 15 timmar redan bilda synapser1. CG nervceller har använts som ett modellsystem genom åren för olika forskningsstudier, på grund av dess relativt enkel isolering och manipulation. Dessa tillämpningar inkluderar optogenetiska studier, synapsutveckling, apoptos och neuromuskulära interaktioner14,15.
Vi beskriver ett detaljerat förfarande för dissekering, dissociation och in vitro kultur ciliary gangli nervceller från embryonala dag 7 (E7) chick embryon. Vi erbjuder ett steg-för-steg-protokoll för att få mycket rena och stabila cellulära kulturer av kolinerga nervceller. Vi lyfter också fram viktiga steg i protokollet som kräver särskild uppmärksamhet och som kommer att förbättra kvaliteten på neuronala kulturer. Dessa kulturer kan upprätthållas in vitro i minst 15 dagar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll visade vi hur man förbereder och kultur CG nervceller. Identifiering och dissekering av ciliary ganglion kan vara svårt för oerfarna användare. Därför presenterar vi en detaljerad och steg-för-steg förfarande för att effektivt dissekera E7 chick ciliary ganglier, separera vävnaden och förbereda neuronala kulturer som kan upprätthållas i minst 15 dagar. Ciliary ganglion nervceller som erhållits med detta protokoll är också lämpliga för samkultur med muskelceller.
<p class="jove_cont…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), genom det regionala operativa programmet Centro 2020 inom projekten CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, och genom COMPETE 2020 – Operativt program för konkurrenskraft och internationalisering och portugisiska nationella medel via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projekt UIDB/04539/2020. UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008 och de enskilda bidragen SFRH/BD/141092/2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) och marie curie-åtgärder – IRG, sjunde ramprogrammet.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Biologie du développement. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
