Isolation og kultur chick ciliary ganglion neuroner
Summary
Chick ciliaere ganglier (CG) er en del af det parasympatiske nervesystem. Neuronal kulturer af chick CG neuroner blev vist sig at være effektive cellemodeller i studiet af nervemuskel interaktioner. Vi beskriver en detaljeret protokol for dissektion, dissociation og in vitro kultur CG neuroner fra kylling embryoner.
Abstract
Chick ciliaere ganglier (CG) er en del af det parasympatiske nervesystem og er ansvarlige for innervation af muskelvæv til stede i øjet. Denne ganglion er konstitueret af en homogen population af ciliaere og choroidal neuroner, der innervatetriated og glatte muskelfibre, henholdsvis. Hver af disse neuronal typer regulere specifikke øjenstrukturer og funktioner. I årenes løb, neuronal kulturer af chick ciliaere ganglier blev vist sig at være effektive cellemodeller i studiet af muskel-nervesystem interaktioner, som kommunikerer gennem kolinriske synapser. Ciliaere ganglion neuroner er, i sit flertal, kolinsyre. Denne celle model har vist sig at være nyttig forholdsvis til tidligere anvendte heterogene cellemodeller, der omfatter flere neuronale typer, foruden kolinsyre. Anatomisk, den ciliaere ganglion er lokaliseret mellem synsnerven (ON) og choroid revne (CF). Her beskriver vi en detaljeret procedure for dissektion, dissociation og in vitro kultur ciliaiske ganglier neuroner fra kylling embryoner. Vi leverer en trinvis protokol for at opnå meget rene og stabile cellulære kulturer af CG neuroner, fremhæver vigtige trin i processen. Disse kulturer kan opretholdes in vitro i 15 dage, og hermed viser vi den normale udvikling af CG kulturer. Resultaterne viser også, at disse neuroner kan interagere med muskelfibre gennem neuro-muskulære kolinsyre synapser.
Introduction
Ciliaere ganglion (CG) neuroner tilhører det parasympatiske nervesystem. Disse neuroner er kolinsyre, at være i stand til at etablere muskcarinic eller nicotinic synapser1,,2,,3. Anatomisk, CG er placeret i den bageste del af øjet mellem synsnerven (ON) og choroid revne (CF) og består af omkring 6000 neuroner i tidlige embryonale stadier1,4. For den første uge i kultur, ciliaere ganglion neuroner præsentere en multipolær morfologi. Efter en uge, de begynder at overgangen til en unipolar tilstand, med en neurite udvide og danne axon5. Desuden dør ca. halvdelen af CG-neuroner mellem den8. th Dette fald i antallet af neuroner resulterer i en samlet population af den ciliaere ganglion på omkring 3000 neuroner6,,7,8. In vitro, der er ingen reduktion i antallet af CG neuroner, når dyrkes med muskelceller9 og CG neuroner kan dyrkes i flere uger1,9.
Den ciliaere ganglion består af en homogen population af ciliaere neuroner og choroidal neuroner, hver repræsenterer halvdelen af den neuronale befolkning i CG, innervating musklen i øjet. Disse to typer af neuroner er strukturelt, anatomisk og funktionelt adskilte. Ciliary neuroner innervate de tværstribede muskelfibre på iris og linse, være ansvarlig for elevsammentrækning. Choroidal neuroner innervate den glatte musklen i choroid1,10,,11,,12.
Kulturer af kylling ciliaere ganglion neuroner har vist sig at være nyttige værktøjer til undersøgelse af neuromuskulære synapser og synapse dannelse1,5,9. I betragtning af at neuromuskulære synapser er kolinsyre13,ved hjælp af en neuronal befolkning, der er kolinsyre – CG neuroner – fremstod som et potentielt alternativ til tidligere cellemodeller14. Disse modeller bestod i en heterogen neuronal population, hvor kun en lille del er kolliner. Alternativt, ciliaere ganglion neuroner udvikle relativt hurtigt in vitro, og efter ca 15 timer allerede form synapser1. CG neuroner har været brugt som et modelsystem gennem årene for forskellige forskningsundersøgelser, på grund af sin relativt let isolation og manipulation. Disse anvendelser omfatter optogenetiske undersøgelser, synapse udvikling, apoptose og neuromuskulære interaktioner14,,15.
Vi beskriver en detaljeret procedure for dissektion, dissociation og in vitro kultur ciliaary ganglier neuroner fra embryonale dag 7 (E7) kylling embryoner. Vi leverer en trin-for-trin protokol for at opnå meget rene og stabile cellulære kulturer af kolinsyre neuroner. Vi fremhæver også de vigtigste trin i protokollen, der kræver særlig opmærksomhed, og som vil forbedre kvaliteten af de neuronale kulturer. Disse kulturer kan opretholdes in vitro i mindst 15 dage.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol demonstrerede vi, hvordan man forbereder og kultur CG neuroner. Identifikation og dissektion af ciliaere ganglion kan være svært for uerfarne brugere. Derfor præsenterer vi en detaljeret og trin-for-trin procedure til effektivt dissekere E7 chick ciliaere ganglier, adskille væv og forberede neuronal kulturer, der kan opretholdes i mindst 15 dage. De ciliaere ganglion neuroner opnået med denne protokol er også velegnet til co-kultur med muskelceller.
Ciliaere ganglier på…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) gennem Centro 2020’s regionale operationelle program under projekter CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS og gennem COMPETE 2020 – Det operationelle program for konkurrenceevne og internationalisering og portugisiske nationale midler via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projekter UIDB/04539/2020 UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, og de individuelle tilskud SFRH/BD/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/141092/14109 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) og af Marie Curie Actions – IRG, 7.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
References
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Biologie du développement. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
