प्राथमिक न्यूरॉन्स में प्रोटीन और सिनैप्टिक मार्कर के सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में प्रोटीन सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को कैसे नियोजित किया जाए।
Abstract
Synapses न्यूरॉन्स के कार्यात्मक तत्व हैं और उनके दोष या नुकसान कई न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोलॉजिकल विकारों के आधार पर हैं। इमेजिंग अध्ययन व्यापक रूप से शारीरिक और रोग स्थितियों में उनके समारोह और प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। उनके आकार और संरचना के कारण, प्रोटीन के स्थानीयकरण अध्ययनों के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स में अध्ययन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जो संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्तर पर सिनैप्टिक मार्कर के साथ लक्षित प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण को कम करता है। सिम एक पैटर्न-प्रकाश रोशनी तकनीक है जो व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प को दोगुना करती है, जो लगभग 100 एनएम की विस्तार तक पहुंचती है। प्रोटोकॉल मजबूत सह-स्थानीयकरण अध्ययनों के लिए आवश्यक नियंत्रण और सेटिंग्स और इमेजिंग डेटा का ठीक से विश्लेषण करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों का अवलोकन इंगित करता है।
Introduction
1897 1 में फोस्टर और शेरिंगटन द्वारा अपने पहले वर्णन के बाद1से सिनैप्स की समझ और दृष्टिकोण में काफी परिवर्तन हुआ है । तब से, न्यूरोनल संचार और इसके पीछे आणविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारा ज्ञान तेजी से2हो गया है । यह स्पष्ट हो गया है कि सिनैप्स को दो-डिब्बे प्रणाली के रूप में सोचा जा सकता है: न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई के लिए वेसिकल युक्त एक पूर्व-सिनैप्टिक डिब्बा और रिसेप्टर्स3के साथ एक पोस्ट-सिनैप्टिक डिब्बे। यह सरलीकृत दृष्टिकोण, पिछले बीस वर्षों में,4संकेत में बाध्यकारी ट्रांसमीटर ट्रांसड्यूस करने के लिए आवश्यक प्रोटीन के एक जटिल नेटवर्क के रूप में विकसित हुआ है ।
समझ में लाभ आंशिक रूप से सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के कारण होता है जो सिनैप्स के आयाम के अनुरूप पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बेहतर 5 ,,6,7,,7,8, 9,,910से आगे ले जाता है। विवर्तन सीमा के कारण, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप 200 एनएम पार्श्व में11, 12,से ऊपर के संकल्प तक नहीं पहुंच सकताहै। इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें बनाई गई थीं, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके और विभिन्न उप-विवर्तन सीमा संकल्पों तक पहुंचने: सिम, एसटीईड (उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी), पाम (फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी) और स्टॉर्म (स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी)13,,14। सिम एक्सिटेशन बीम पथ15में एक विवर्तन झंझरी डालने से लेजर आधारित वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी सिस्टम के स्थानिक संकल्प को दोगुना कर देता है । चल झंझरी एक ज्ञात रोशनी पैटर्न, आमतौर पर धारियों बनाने के लिए लेजर बीम विवर्तित करता है। यह जानबूझकर संरचित प्रकाश पैटर्न फ्लोरोसेंट डाई (नमूने के) के अज्ञात स्थानिक वितरण के लिए आरोपित है। दो पैटर्न द्वारा गठित हस्तक्षेप किनारे सामान्य व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ अन्यथा अविवेच्य ठीक विवरण के लिए एन्कोड करते हैं। अंतिम सुपर-हल छवि को गणितीय विधियों के साथ संयोजन और डिकोडिंग करके प्राप्त किया जाता है, जो विवर्तन झंझरी के अनुवाद और घूर्णन द्वारा प्राप्त एक ही नमूने की कई कच्ची छवियों के साथ होता है। सुपर-हल छवियों का संकल्प पार्श्व में 100 एनएम और पार्श्व में 2डी-सिम 15 या 100 एनएम के लिए अक्षीय दिशाओं में500 एनएम तक पहुंचता है और 3डी-सिम16के लिए अक्षीय दिशाओं में 250 एनएम।
सिनैप्स की नई समझ कई न्यूरोलॉजिकल विकारों के आलोक में और भी महत्वपूर्ण है जहां सिनैप्टिक रोग शुरुआत और प्रगति में प्रमुख भूमिका निभाता है17,18. अल्जाइमर रोग, डाउन सिंड्रोम, पार्किंसंस रोग, प्रिन रोग, मिर्गी, ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार और नाजुक एक्स सिंड्रोम को सिनैप्टिक संरचना, आकृति विज्ञान और कार्य19,20, 21,,,22में असामान्यताओं से जोड़ा गया है।,21
हाल ही में, सुमो-विशिष्ट एंटीबॉडी के एक सेट का उपयोग करके, हमने सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्तर23पर पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक मार्कर सिंप्टोफिजिन और PSD95 के साथ सूमो प्रोटीन के प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में सह-स्थानीयकरण दिखाने के लिए सिम का उपयोग किया। इसने हमें न्यूरॉन्स में सुमो स्थानीयकरण के जैव रासायनिक और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी साक्ष्य की पुष्टि करने में सक्षम बनाया।
यहां, हम माउस हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स में प्रोटीन के स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। साथ ही, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार की प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों के अनुकूल बनाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संरचना और सिनैप्स की संरचना को स्पष्ट करना शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जो स्मृति और अनुभूति को विनियमित करते हैं। जबकि सामान्य स्थिति में, सिनेप्स स्मृति के निर्माण खंड ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि की रचनात्मक आलोचना के लिए एडोआर्डो मिकोटी का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस अध्ययन को ब्राइटफोकस A2019296F द्वारा समर्थित किया गया था, फोडो डी बेनेफिसेंज़ा – ग्रुप्पो इंटेसा सैंपाओलो (एलसी), फोंडाजिओन रीजनल प्रति ला राइसरिका बायोमेडिका (Care4NeuroRare CP_20/2018) (सीएन) और मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी इनोवेटिव ट्रेनिंग नेटवर्क (जेके) द्वारा।
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
