Vi beskriver prosedyren for in vitro differensiering av musen embryonale stamceller i nevronale celler ved hjelp av hengende dråpemetode. Videre utfører vi en omfattende fenotypisk analyse gjennom RT-qPCR, immunfluorescens, RNA-seq og strømningscytometri.
Vi beskriver den trinnvise prosedyren for dyrking og differensiering av museembreniske stamceller i nevronale avstamninger, etterfulgt av en rekke analyser for å karakterisere de differensierte cellene. E14-musens embryonale stamceller ble brukt til å danne embryoide kropper gjennom den hengende dråpemetoden, og deretter indusert til å skille seg ut i nevrale stamceller ved retinoinsyre, og til slutt differensiert til nevroner. Kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) og immunfluorescenseksperimenter viste at nevrale forfedre og nevroner viser tilsvarende markører (nestin for nevrale forfedre og nevrofilament for nevroner) på henholdsvis dag 8 og 12 postdifferensiering. Flow cytometrieksperimenter på en E14-linje som uttrykker en Sox1 promotordrevet GFP-reporter viste at omtrent 60% av cellene på dag 8 er GFP-positive, noe som indikerer vellykket differensiering av nevrale stamceller på dette stadiet. Til slutt ble RNA-seq-analyse brukt til å profilere de globale transkripsjonsendringene. Disse metodene er nyttige for å analysere involvering av spesifikke gener og veier for å regulere celleidentitetsovergangen under nevronal differensiering.
Siden deres første avledning fra den indre cellemassen til de utviklende mus blastocystene1,2, har musens embryonale stamceller (mESC) blitt brukt som kraftige verktøy for å studere stamcelle selvfornyelse og differensiering3. Videre fører studier av mESC-differensiering til enorm forståelse av molekylære mekanismer som kan forbedre effektiviteten og sikkerheten i stamcellebasert terapi ved behandling av sykdommer som nevrodegenerative lidelser4. Sammenlignet med dyremodeller gir dette in vitro-systemet mange fordeler, inkludert enkelhet i praksis og vurdering, lave kostnader ved å opprettholde cellelinjer i motsetning til dyr, og relativt enkel i genetiske manipulasjoner. Effektiviteten og kvaliteten på differensierte celletyper påvirkes imidlertid ofte av forskjellige linjer med MESCer samt differensieringsmetodene5,6. De tradisjonelle analysene for å evaluere differensieringseffektivitet er også avhengige av kvalitativ undersøkelse av utvalgte markørgener som mangler robusthet, og de klarer derfor ikke å forstå globale endringer i genuttrykk.
Her tar vi sikte på å bruke et batteri av analyser for systematisk vurdering av nevronal differensiering. Ved hjelp av både tradisjonelle in vitro-analyser på utvalgte markører og RNA-seq etablerer vi en plattform for måling av differensieringseffektivitet samt transkripsjonsendringer under denne prosessen. Basert på en tidligere etablert protokoll7genererte vi embryoide legemer (EBs) gjennom hengende dråpeteknikk, etterfulgt av induksjon ved hjelp av stikkfysiologiske mengder retinoinsyre (RA) for å generere nevrale stamceller (NPCer), som senere ble differensiert til nevroner med nevral induksjonsmedium. For å undersøke effektiviteten av differensiering, i tillegg til tradisjonelle RT-qPCR og immunfluorescence (IF) analyser, utførte vi RNA-seq og strømningscytometri. Disse analysene gir omfattende måling av progresjonen av den scenespesifikke differensieringen.
Metoden for nevral differensiering av musens embryonale stamceller har blitt etablert i flere tiår, og forskere har fortsatt å endre de tidligere protokollene eller lage nye for ulike formål7,10,11. Vi benyttet en rekke analyser for å analysere effektiviteten og fremdriften av differensieringsstadiene av mESC til nevroner, som kan brukes til analyse av annen avstamningsdifferensiering av mus eller menneskelige ESCer. Videre …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (1R35GM133496-01) til Z. Gao. Vi vil takke Dr. Ryan Hobbs for hjelpen med seksjonering. Vi takker Penn State College of Medicines kjernefasiliteter, inkludert Genome Sciences and Bioinformatics, Advanced Light Microscopy Imaging og Flow Cytometry. Vi takker også Dr. Yuka Imamura for hjelpen i RNA-seq analyse.
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BD FACSCanto | BD | 657338 | |
bFGF | Sigma | 11123149001 | |
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
DAPI | Invitrogen | R37606 | |
DMEM | Corning | 10-017-CM | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EB buffer | Qiagen | 19086 | |
Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
– Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
– Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
– Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |