Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Résumé

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Résumé

Les cellules de mammifères sont constamment exposées à des produits chimiques, des radiations et des sous-produits métaboliques naturels, qui créent des types spécifiques d’insultes à l’ADN. Les agents génotoxiques peuvent endommager l’épine dorsale de l’ADN, la briser ou modifier la nature chimique des bases individuelles. Suite à l’insulte à l’ADN, les voies de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) sont activées et les protéines impliquées dans la réparation sont recrutées. Une pléthore de facteurs sont impliqués dans la détection du type de dommages et l’activation de la réponse de réparation appropriée. L’incapacité d’activer et de recruter correctement des facteurs de DDR peut conduire à l’instabilité génomique, qui sous-tend de nombreuses pathologies humaines, y compris le cancer. Les études sur les protéines DDR peuvent fournir des informations sur la réponse aux médicaments génotoxiques et les mécanismes cellulaires de la résistance aux médicaments.

Il existe deux façons principales de visualiser les protéines in vivo : l’observationdirecte, en taguant la protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente et en la suivant par imagerie vivante, ou l’immunofluorescence indirecte sur des échantillons fixes. Bien que la visualisation des protéines étiquetées fluorescentes permette une surveillance précise au fil du temps, le marquage direct dans le terminus N ou C peut interférer avec la localisation ou la fonction des protéines. L’observation des protéines dans leur version endogène non modifiée est préférable. Lorsque les protéines de réparation d’ADN sont recrutées à l’insulte de l’ADN, leur concentration augmente localement et elles forment des groupes, ou « foyers », qui peuvent être visualisés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps spécifiques.

Bien que la détection des foyers protéiques ne fournisse pas de preuve définitive de l’interaction directe, la co-localisation des protéines dans les cellules indique qu’elles se regroupent jusqu’au site des dommages et peuvent éclairer la séquence des événements nécessaires à la formation complexe. Une analyse minutieuse des foyers se chevauchent dans les cellules exprimant des versions sauvages ou mutantes d’une protéine peut fournir des indices précieux sur des domaines fonctionnels importants pour la fonction de réparation de l’ADN. Enfin, la co-localisation des protéines indique des interactions directes possibles qui peuvent être vérifiées par co-immunoprécipation dans les cellules, ou retrait direct à l’aide de protéines purifiées.

Introduction

Les cellules humaines sont constamment exposées à une variété d’agents d’ADN endommageant de diverses origines. Les sources exogènes consistent principalement en l’exposition aux radiations, aux produits chimiques (y compris les agents chimiothérapeutiques et certains antibiotiques) et aux virus, tandis que les principales sources endogènes comprennent des erreurs dans la réplication de l’ADN et le stress oxydatif. Les effets directs de l’exposition génotoxique peuvent aller d’une base modifiée à une rupture potentiellement mortelle à double brin d’ADN (DSB), selon le stress et la dose d’exposition. En fin de compte, les dommages non réparés ou mal réparés à l’ADN peu....

Protocole

1. Culture cellulaire HeLa

1. Prétraiter les couvercles ronds en verre de 1 M HCl à 50 °C pendant 16-18 heures. Rincer avec ddH₂O et conserver dans 100% EtOH.
2. Préparer le milieu de culture cellulaire : ajouter 10 % (v/v) FBS au milieu DMEM.
3. Cultiver 4,0 x 10⁴ cellules/puits dans une plaque stérile de 12 puits avec une couverture en verre rond de 18 mm à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié. Développer les cellules à 80% de confluence (environ 24 heures).

2. Traitement cellulaire par rayonnement (IR)

1. Pour induire la formation de ruptures à double brin, ex....

Résultats

Le jour 2, ou 24 h après les cellules d’ensemencement sur les couvercles, les cellules ont subi une division et sont confluentes à 80%. Des baisses ou des mutations spécifiques dans les protéines de réparation de l’ADN peuvent augmenter le temps de doublement, ou sensibiliser les cellules au traitement génotoxique, et la densité d’ensemencement ainsi que les doses de traitement devraient être ajustées en conséquence. Pour déterminer les meilleures conditions de travail, le moment de la réponse aux dommages à l’ADN peut ê.......

Discussion

L’analyse du moment et de l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN par microscopie s’est avérée essentielle pour comprendre le fonctionnement de la machinerie de réparation de l’ADN, dans les cellules normales et dans les pathologies humaines telles que le cancer.

Le développement d’anticorps spécifiques qui permettent la détection de protéines activées dans leur version phosphorylé (tels que γH2AX, pRPA, pRAD50 et autres^10,23

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % (v/v) de paraformaldéhyde (PFA) solution aqueuse	Microscopie électronique Sciences	15710	qualité de microscopie du PFA garantit les meilleures images. Si vous utilisez du « PFA fait maison », filtrez avant utilisation.
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	La fraction de choc thermique est recommandée, pour éviter les précipitations/le bruit de fond.
Coverglass #1, rond de 18 mm (lamelles)	NC0308920	Neuvitro	doivent être nettoyées et stérilisées avant d’être utilisées, avec du HCl ou de l’éthanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4,5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Pyruvate de sodium]	Gibco	11965118	Ajustez le milieu de culture aux besoins de la lignée cellulaire utilisée.
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190144	PBS pour la culture tissulaire.
Éthylène glycol-bis(&bêta ;-aminoéthyl éther)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique (EGTA)	Research Products International	E57060	Tampon d’extraction nucléaire.
Sérum fœtal bovin (FBS)	Life Technologies	104370028	La qualité du FBS peut être évaluée en testant la formation de foyers gH2AX. Si des traces d’endotoxine génotoxique sont présentes dans le lot, gH2AX sera positif en l’absence de stress.
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Research Products International	M24000	Tampon d’extraction nucléaire.
Pipérazine-N,N&prime ;-bis(acide 2-éthanesulfonique) (PIPES)	Research Products International	P40150	Tampon d’extraction nucléaire.
SlowFade Diamond Antifade Mountant avec DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI avec support de montage VECTASHIELD Antifade peut être utilisé à la place.
Chlorure de sodium (NaCl)	Research Products International	S23020	Tampon d’extraction nucléaire.
Sucrose	Research Products International	S24060	Tampon d’extraction nucléaire.
Les lames de microscope Fisherbrand		1255015	lames en polysinus peuvent être utilisées à la place.
Plaques à puits multiples traitées TC, taille 12 puits	Costar	3513	L’ensemencement sur lamelles se fait en plaque à 12 puits.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Tampon d’extraction nucléaire.
L’enzyme TrypLE Express (1X), le Gibco sans rouge de phénol		12604021	trypsine-EDTA peuvent être utilisés à la place.
Trypsine-EDTA (0,5 %), pas de rouge de phénol	Gibco	15400054	TrypLE peuvent être utilisés à la place.

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