Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

B&#225;rbara de la Pe&#241;a Avalos; Elo&#239;se Dray

doi:10.3791/61447

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Biologie

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Published: June 26, 2020

doi:

10.3791/61447

Bárbara de la Peña Avalos², Eloïse Dray²

¹Department of Biochemistry and Structural Biology,University of Texas Health Science Center at San Antonio, ²Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l’integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell’immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l’interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Abstract

Le cellule dei mammiferi sono costantemente esposte a sostanze chimiche, radiazioni e sotto-prodotti metabolici naturali, che creano tipi specifici di insulti al DNA. Gli agenti genotossici possono danneggiare la spina dorsale del DNA, romperla o modificare la natura chimica delle singole basi. In seguito all’insulto al DNA, vengono attivati percorsi di risposta al danno del DNA (DDR) e vengono reclutate proteine coinvolte nella riparazione. Una pletora di fattori sono coinvolti nel rilevamento del tipo di danno e nell’attivazione della risposta di riparazione appropriata. La mancata attivazione e reclutamento dei fattori DDR può portare all’instabilità genomica, che sta alla base di molte patologie umane, tra cui il cancro. Studi sulle proteine DDR possono fornire informazioni sulla risposta ai farmaci genotossici e sui meccanismi cellulari della resistenza ai farmaci.

Ci sono due modi principali per visualizzare le proteine in vivo:l’osservazione diretta, etichettando la proteina di interesse con una proteina fluorescente e seguendola mediante imaging dal vivo, o immunofluorescenza indiretta su campioni fissi. Mentre la visualizzazione delle proteine con tag fluorescenti consente un monitoraggio preciso nel tempo, l’etichettatura diretta in N- o C-terminus può interferire con la localizzazione o la funzione delle proteine. L’osservazione delle proteine nella loro versione non modificata ed endogena è preferita. Quando le proteine di riparazione del DNA vengono reclutate nell’insulto del DNA, la loro concentrazione aumenta localmente e formano gruppi, o “foci”, che possono essere visualizzati dall’immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici.

Anche se il rilevamento di proteine foci non fornisce una prova definitiva di interazione diretta, la co-localizzazione delle proteine nelle cellule indica che si raggruppano al sito del danno e possono informare della sequenza degli eventi necessari per la formazione complessa. Un’attenta analisi della sovrapposizione spaziale dei foci nelle cellule che esprimono versioni di tipo selvaggio o mutante di una proteina può fornire preziosi indizi su domini funzionali importanti per la funzione di riparazione del DNA. Infine, la co-localizzazione delle proteine indica possibili interazioni dirette che possono essere verificate dalla co-immunoprecipizione nelle cellule o dal pulldown diretto utilizzando proteine purificate.

Introduction

Le cellule umane sono costantemente esposte a una varietà di agenti dannosi per il DNA di varie origini. Le fonti esogene sono per lo più costituite da esposizione a radiazioni, sostanze chimiche (compresi agenti chemioterapici e alcuni antibiotici), e virus, mentre le principali fonti endogene includono errori nella replicazione del DNA e nello stress ossidativo. Gli effetti diretti dell’esposizione genotossica possono variare da una base modificata a una rottura del doppio filamento del DNA potenzialmente letale (DSB), a seconda dello stress e della dose di esposizione. In definitiva, danni al DNA non riparati o riparati in modo improprio possono portare all’accumulo di mutazioni, riarrangiamenti genomici, instabilità del genoma e alla fine portare alla carcinogenesi¹. Le cellule dei mammiferi hanno sviluppato percorsi complessi per riconoscere specifici tipi di danni al DNA²^,³ e ripararli in modo tempestivo, sincronizzati con la progressione del ciclo cellulare.

Le radiazioni ionizzanti (IR) danneggiano la doppia elica del DNA e creano rotture a doppio filamento (DSB), una delle forme più deleteri di danno al DNA. Il complesso MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funziona come un sensore di DNA termina e attiva la proteina chinasi ataxia telangiectasia mutato (ATM)⁴^,⁵. Dopo l’attivazione iniziale di ATM da fini dna, ATM innesca una cascata di eventi DDR sul sito della rottura, avviando con un evento chiave, la fosforilazione della variante istone H2AX⁶. La fosforilazione H2AX sui residui S139 la attiva in γH2AX, che si estende su regioni fino a megabase intorno alla lesione del DNA⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Questo evento aumenta l’accessibilità del DNA, portando al reclutamento e all’accumulo di altre proteine di riparazione del DNA⁷. Poiché γH2AX è abbondantemente e specificamente indotto DSBs circostanti, può essere facilmente visualizzata utilizzando anticorpi specifici, ed è comunemente usato come marcatore surrogato per DSB nel campo di riparazione del DNA. Una volta segnalata la rottura, le cellule attivano le loro vie di riparazione del DNA ed elaborano il danno al DNA. La proteina MDC1 (mediatore della proteina checkpoint del danno al DNA 1) lega direttamente γH2AX^10,interagisce con ATM¹¹ e anche con NBS1^12,^,¹³. Contribuisce ad aumentare la concentrazione del complesso MRN presso il DSB e ad avviare un ciclo di feedback ATM positivo. γH2AX viene rapidamente rimosso una volta riparata la rottura, consentendo di conseguenza il monitoraggio dell’autorizzazione DSB. Seguita dalla microscopia, la diminuzione della γH2AX nel tempo fornisce una misurazione indiretta delle rotture residue e dell’efficienza di riparazione del DNA.

Le cellule eucariotiche possono riparare i DSB da diversi percorsi, mentre le due principali sono l’unione finale non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) (Figura 1). NHEJ lega essenzialmente il DNA a doppio filamento termina senza l’uso di omologia estesa e opera per tutto il ciclo^{cellulare 14}^,¹⁵. HR diventa predominante durante le fasi S e G2, ed è altrimenti represso, dal momento che richiede una sorella cromata come modello omologa per la^{riparazione 14}^,¹⁶. La scelta del percorso tra NHEJ e HR dipende non solo dalla vicinanza fisica della sorella cromatica, ma anche dall’estensione della resezione finale del DNA¹⁷, che inibisce NHEJ.

La riparazione DSB dipendente dall’omologia inizia con la degradazione nucleolitica del filamento 5′ dalle estremità di rottura per generare code di DNA a 3′ filamento singolo (ssDNA), un processo denominato resezione 5′-3′. Il complesso MRN avvia la resezione finale del DNA e l’ulteriore resezione viene elaborata in combinazione con BLM/EXO1 (Proteina sindrome di Bloom/esonucleasi 1) o BLM/DNA2 (replicazione del DNA Elicase/nucleasi dipendente da ATP)¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²². La resezione finale del DNA è potenziata dal CtIP (proteina che interagisce con il CtBP) attraverso la sua interazione diretta con il complesso MRN²³ e il reclutamento di BRCA1 (proteina di suscettibilità al tipo 1 del cancro al seno)²⁴^,²⁵. La proteina di replica A (RPA) si lega prontamente alla ssDNA esposta e viene quindi spostata dalla proteina ricombinata RAD51 per formare un filamento nucleoproteina che catalizza la ricerca omologa e l’invasione^{del filamento 26}^,²⁷^,²⁸.

L’avvio della resezione è un passo critico per la scelta del percorso di riparazione. Una volta avviata la resezione, le estremità del DNA diventano substrati poveri per la legazione da parte dell’eterodimero Ku70/Ku80 (componente del percorso NHEJ) e le cellule sono impegnate in HR¹⁷^,²⁹^,³⁰. L’eterodimero Ku70/Ku80 si lega alle estremità DSB, reclutando DNA-PKcs e p53 Binding Protein 1 (53BP1)²⁹^,³⁰. 53BP1 agisce come una barriera alla resezione in G1, bloccando così le risorse umane durante la promozione di NHEJ³¹^,³², ma viene rimosso in modo dipendente da BRCA1 nella fase S, consentendo di conseguenza la resezione³³^,³⁴. Pertanto, 53BP1 e BRCA1 svolgono ruoli opposti nella riparazione DSB, con 53BP1 essendo un facilitatore NHEJ mentre BRCA1 agisce consentendo interruzioni per la riparazione attraverso HR.

In laboratorio, la formazione di DSB può essere indotta da radiazioni ionizzanti (IR). Mentre questo esempio utilizza una dose elevata di 4 Gy, 1 Gy e 2 Gy anche creare una quantità significativa di DSB, adatto per l’analisi della formazione di foci da proteine abbondanti. È importante notare che il tipo e la dose di radiazioni utilizzate possono portare a diverse lesioni nel DNA e nella cellula: mentre l’IR induce ISB, può anche causare rotture di singoli filamenti o modificazione della base (vedi³⁵^,³⁶ per un riferimento sul trasferimento di energia lineare di irradiazione (LET) e sul tipo di danno al DNA). Per determinare la cinetica della formazione di foci ionizzanti indotta da radiazioni (IRIF) e la loro distanza, che indicano la riparazione del danno e l’inversione del DDR^{attivato 8}^,⁹^,³⁷^,³⁸, la formazione di foci può essere monitorata in diversi punti di tempo dopo la radiazione ionizzante. La tempistica di attivazione e di sgombero di tutte le principali proteine danno del DNA^{è nota 39}, e molti sono studiati come marcatori surrogati di eventi chiave. Ad esempio, pRPA, che possiede un’elevata affinità per ssDNA viene utilizzato come surrogato della resezione di rottura, le proteine MRN (MRE11, RAD50, NBS1) e le esonucleasi possono essere utilizzate anche per valutare l’efficienza della resezione. Mentre RAD51, BRCA1, BRCA2 (proteina di suscettibilità al cancro al seno 2) e PALB2 (partner e localizzatore di BRCA2) possono essere monitorati per valutare l’efficienza delle risorse umane, la presenza delle proteine Ku o 53BP1, vengono utilizzati come marcatori di NHEJ(Figura 1).

Poiché le proteine del macchinario per la riparazione del DNA si reclutano a vicenda per la rottura e l’assemblaggio in super-complessi, le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina possono essere dedotte seguendo la loro localizzazione individuale nel tempo e analizzando la co-localizzazione delle proteine, come viene visualizzazioneto da segnali sovrapposti nella cella⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Nelle linee cellulari, l’introduzione di mutazioni puntino o la cancellazione in specifici geni di riparazione del DNA sia attraverso l’editing del genoma, sia per sovraespressione di mutanti a base di plasmidi, consente di eseguire lo studio di residui specifici e del loro possibile ruolo nel riconoscimento del danno al DNA (ad esempio, la co-localizzazione con γH2AX) o di un assemblaggio complesso (co-localizzazione con un’altra o più proteine), nonché il loro impatto sulla riparazione del DNA. Qui, usiamo l’immunofluorescenza indiretta come mezzo per studiare la formazione e la risoluzione dei DSB seguendo γH2AX foci nel tempo. Presentiamo anche un esempio di formazione di foci e analisi di co-localizzazione da parte di un attore importante nella riparazione DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)³². Come accennato in precedenza, 53BP1 è considerato centrale per la scelta del percorso di riparazione del DNA. Dopo l’accumulo di 53BP1 e la sua co-localizzazione con γH2AX fornisce preziose informazioni sulla fase del ciclo cellulare, l’accumulo di danni al DNA e il percorso utilizzato per riparare i DSB. Lo scopo dell’immunolocalizzazione indiretta è quello di valutare l’efficienza della riparazione dei danni al DNA nelle linee cellulari, seguendo IR come in questo studio, o dopo l’esposizione a varie sollecitazioni nelle cellule, dal collegamento incrociato del DNA al blocco della forchetta di replica (un elenco di agenti dannosi per il DNA è fornito nella tabella 1).

Figura 1: Vie di riparazione del doppio filamento del DNA (DSB).
La riparazione DSB prevede due percorsi principali: la ricombinazione omologa (HR, a sinistra) e l’end-joining non omologho (NHEJ, a destra). Dopo la pausa, le proteine si attivano per contrassegnare la rottura (γH2AX), partecipare alla resezione finale (MRN), rivestire la ssDNA resected (pRPA), promuovere la ricombinazione (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) o limitare la resezione e promuovere NHEJ (53BP1). Altre proteine partecipano alla riparazione dei danni, ma le proteine elencate sono regolarmente seguite dall’immunofluorescenza indiretta. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Agente dannoso del DNA	Meccanismo d’azione	Dose raccomandata
γ/raggi X	Radiazione Formazione di rotture a doppio filamento con alcuni effetti cellulari incontrollati	1-4 Gy
^{Il numero 36 del 36} Ar ioni	Radiazione Formazione di rotture a doppio filamento	270 keV/m
particelle z	Radiazione Formazione di rotture a doppio filamento	116 keV/m
Bleomicina	Inibitore della sintesi del DNA	0,4-2 g/mL
Camptothecin	Inibitore della topoisomerasi I	10-200 nM
Cisplatino	Agente di Alkylating (inducendo collegamenti incrociati intrastranti)	0,25-2 M
Doxorubicina	Agente intercalante Inibitore della topoisomera II	10-200 nM
Etoposide	Inibitore della topoisomera II	10 SM
Hydroxyurea	Inibitore della sintesi del DNA (per ribonucleotide reductase)	10-200 M
Metano metilesulfonato	Agente di Alkylating	0,25-2 mM
Mitomicina C	Agente di Alkylating	0,25-2 M
Luce ultravioletta (UV)	Formazione di dimeri di timodina (generando distorsione della catena del DNA)	50-100 mJ/cm²

Tabella 1: agenti genotossici. Esempi di agenti dannosi per il DNA, il loro meccanismo d’azione e il danno indotto sulla base della concentrazione di lavoro suggerita.

Protocol

1. Coltura cellulare HeLa Il vetro rotondo pre-trattamento copre le coperture con 1 M HCl a 50 gradi centigradi per 16-18 ore. Risciacquare con ddH2O e conservare al 100% EtOH. Preparare il supporto di coltura cellulare: aggiungere il 10% (v/v) FBS al supporto DMEM. Crescere 4,0 x 104 celle/bene in una piastra sterile a 12 possidetti con un coperture rotonde da 18 mm a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 in un’incubatrice umida. Coltivare le cellule fino all’80% …

Representative Results

Il giorno 2, o 24 h dopo le cellule di semina su coverslips, le cellule hanno subito una divisione e sono 80% confluente. Specifici abbattimenti o mutazioni nelle proteine di riparazione del DNA possono aumentare il tempo di raddoppio, o sensibilizzare le cellule al trattamento genotossico, e la densità di semina e le dosi di trattamento devono essere regolate di conseguenza. Per determinare le migliori condizioni di lavoro, la tempistica della risposta al danno del DNA può essere stabilita dal gonfiore occidentale di …

Discussion

L’analisi dei tempi e dell’efficienza della riparazione dei danni al DNA tramite microscopia si è dimostrata essenziale per capire come funziona il macchinario per la riparazione del DNA, nelle cellule normali e nelle patologie umane come il cancro.

Lo sviluppo di anticorpi specifici che consentono il rilevamento di proteine attivate nella loro versione fosforicolata (come γH2AX, pRPA, pRAD50 e altri^10,^,²³^,<sup class="xref…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Area San Antonio. Il Mays Cancer Center è supportato dalla sovvenzione core di supporto al centro oncologico NCI P30 CA054174. Vorremmo ringraziare Stephen Holloway per il suo aiuto nell’approvvigionamento delle reagenti e il laboratorio Sung per aver fornito spazio e capacità di microscopia.

Materials

16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)	Neuvitro	NC0308920	Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]	Gibco	11965118	Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Research Products International	E57060	Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	104370028	The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl₂)	Research Products International	M24000	Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuclear extraction buffer.
Sucrose	Research Products International	S24060	Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells	Costar	3513	Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red	Gibco	15400054	TrypLE can be used instead.

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Citer Cet Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).